Immunomodulerende metaboliete zien ‘n sleutelkenmerk vaan de tumormicro-umgeving (TME), mer mit ‘n paar oetzunderinge blief hun identiteit groetendeils oonbekind. Hei analyseerde veer tumore en T-celle oet de tumore en ascites vaan patiënte mit hooggraad serous carcinoom (HGSC) um ‘t metaboloom vaan dees versjillende TME-compartimente te onthulle. Ascites en tumorcelle höbbe oetgebreide metabolietversjèlle. In vergelieking mit ascites, zien de tumor-infiltrerende T-celle significant verriek mit 1-methylnicotinamide (MNA). Al is ‘t niveau vaan MNA in T-celle verheug, is de expressie vaan nicotinamide N-methyltransferase (‘n enzym dat de euverdrach vaan methylgroepe vaan S-adenosylmethionine nao nicotinamide katalyseert) beperk tot fibroblaste en tumorcelle. Functioneel induceert MNA T-celle um de tumor-promoterende cytokine tumornecrosefactor alfa te sjeije. Daorum draag TME-aafgeleid MNA bij aon de immuunregulering vaan T-celle en representeert ‘n potentieel immunotherapiedoelwit veur de behandeling vaan minseleke kanker.
Vaan tumor aafgeleide metaboliete kinne un deepgaond remmende effek höbbe op anti-tumor immuniteit, en steeds mie bewies toent aon tot ze ouch kinne dene es un belangrieke drievende krach veur de progressie vaan de krenkde (1). Neve ut Warburg-effect is recent werk begoos um de metabolische sjtaot vaan tumorcelle en de relatie devaan mit de immuunstaot vaan de tumormicro-umgeving (TME) te karakterisere. Oonderzeuke op moesmodelle en minseleke T-celle höbbe aongetoend dat glutamine-metabolisme (2), oxidatieve metabolisme (3) en glucose-metabolisme (4) onaafhenkelek kinne wèrke op versjillende immuuncel-subgróppe. Versjèllende metaboliete in dees paajer remme de anti-tumorfunctie vaan T-celle. ‘t Is beweze dat de blokkade vaan ‘t coenzym tetrahydrobiopterine (BH4) de proliferatie vaan T-celle kin beschadige, en de touwnaome vaan BH4 in ‘t lief de anti-tumor-immuunrespons kin verbetere, gemedieerd door CD4 en CD8. Daoneve kin ‘t immunosuppressieve effek vaan kynurenine weure gered door de toediening vaan BH4 (5). In isocitraatdehydrogenase (IDH) mutant glioblastoom remt de secretie vaan enantiometabolisch (R)-2-hydroxyglutaraat (R-2-HG) T-celactivatie, proliferatie en cytolyseactiviteit (6). Onlangs is aongetoond dat methylglyoxal, un bijproduk vaan glycolyse, weurt geproduceerd door suppressorcelle vaan myeloïde aafkoms, en dat de T-celtransfer vaan methylglyoxal de effector-T-celfunctie kin remme. In de behandeling kin de neutralisatie vaan methylglyoxal de activiteit vaan myeloïde-aafgeleide suppressorcelle (MDSC) euverwinne en de checkpoint-blockadetherapie in moesmodelle synergisch verbetere (7). Dees studies benaodrökke same de sleutelrol vaan TME-aafgeleide metaboliete in ‘t regulere vaan de functie en activiteit vaan de T-cel.
T-celdysfunctie is oetgebreid gerapporteerd bij eierstokkanker (8). Dit is deils te wiete aon de metabolische kenmerke die inherènt zien aon hypoxie en abnormale tumorvasculatuur (9), wat resulteert in de umzètting vaan glucose en tryptofaan in bijprodukte wie melkzuur en kynurenine. Excessief extracellulair lactaat vermindert de productie vaan interferon-γ (IFN-γ) en drijf de differentiatie vaan myelosuppressieve subgróppe (10, 11). De consumptie vaan tryptofaan remt de proliferatie vaan T-cel direk en remt de signalering vaan de T-celreceptor (12-14). Ondanks dees woerneuminge woort väöl werk roond de immuunmetabolisme oetgeveurd in in vitro T-celkweek met behulp vaan geoptimaliseerde media, of beperk tot homologe muismodelle in vivo, boevaan gein vaan beide de heterogeiteit vaan minseleke kanker en de fysiologische macro- en micro-umgeving volledeg weerspiegelt.
‘n Gemeinsjappelek kenmerk vaan eierstokkanker is peritoneale verspreijing en ‘t versjijne vaan ascites. De huiping vaan celvloeistof in ascites is geassocieerd mit ‘n geavanceerde krenkde en ‘n slechte prognose (15). Volgens rapporte is dit unieke compartiment hypoxisch, heet ‘t hoege niveaus vaan vasculaire endotheliale greujfactor (VEGF) en indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) en is ‘t geïnfiltreerd door T-regulerende celle en myeloïde remmende celle (15-18). De metabolische umgeving vaan ascites kin aanders zien es die vaan de tumor zelf, dus ‘t herprogrammere vaan T-celle in de peritoneale ruimte is ondudelek. Daoneve kinne de belangriekste versjille en heterogeiteit tusse ascites en metaboliete die in de tumorumgeving aanwezeg zien de infiltratie vaan immuuncelle en hun functie op tumore belemmere, en weijer oonderzeuk is nuudig.
Um dees probleme op te losse, höbbe veer ‘n LC-MS/MS-methode ontworpe um versjillende celtypes (inclusief CD4 + en CD8 + T-celle) en ouch binne en tusse tumore te bestudere. Ver gebruke dees methode same mit high-dimensional flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) um un hoeg opgelos beeld te geve vaan de metabolische status vaan dees sleutelpopulaties. Dees methode onthulde ‘n significante touwnaome in ‘t niveau vaan 1-methylnicotinamide (MNA) in tumor-T-celle, en in vitro-experiminte leete zien dat ‘t immunomodulerende effek vaan MNA op de functie vaan T-celle nog neet bekind waor. In ‘t algemein onthult dees methode de wederzijdse metabolische interacties tusse tumore en immuuncelle, en gief unieke inzich in immuunreguleringsmetaboliete, die nuttig kinne zien veur de behandeling vaan op T-celle gebaseerde immunotherapie vaan eierstokkanker.
We gebruukde high-dimensional flowcytometrie um tegeliekertied de glucose-opname te kwantificere [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) en mitochondriale activiteit [MitoTracker Deep Red (MT DR)) (77, 2019) zijde typische markers die immuuncelle en tumorcellepopulaties oondersjeie (Tabel S2 en Figuur S1A). Dees analyse leet zien dat in vergelieking mit T-celle, ascites en tumorcelle hoeger glucose-opnameniveaus höbbe, mer kleiner versjille in mitochondriale activiteit höbbe. De gemiddelde glucose-opname vaan tumorcelle [CD45-EpCAM (EpCAM)+] is drie tot veer keer zoe groet es die vaan T-celle, en de gemiddelde glucose-opname vaan CD4 + T-celle is 1,2 keer zoe groet es die vaan CD8 + T-celle, wat aonguuf dat Tumor-infiltrerende lymfocyte (TIL) zelfs in dezelfde TME versjèllende metabolische vereiste höbbe (Figuur 1). Daoretege is de mitochondriale activiteit in tumorcelle geliek aon die vaan CD4 + T-celle, en de mitochondriale activiteit vaan beide celtypes is hoeger es die vaan CD8 + T-celle (Figuur 1B). In ‘t algemein, dees resultate toene ‘t stofwisselingsniveau. De metabolische activiteit vaan tumorcelle is hoeger es die vaan CD4 + T-celle, en de metabolische activiteit vaan CD4 + T-celle is hoeger es die vaan CD8 + T-celle. Ondanks dees effecte tösse celtypes, is d’r gein consistent versjil in de metabolische status vaan CD4 + en CD8 + T-celle of hun relatieve proporties in ascites in vergelieking mit tumore (Figuur 1C). Daoretege, in de CD45-celfractie, naom ‘t aondeil EpCAM+-celle in de tumor touw in vergelieking mit ascites (Figuur 1D). Ver höbbe ouch un duudelik metabolisch versjil tusse EpCAM+ en EpCAM-celcomponente gezeen. EpCAM+ (tumor) celle höbbe ‘n hoegere glucose-opname en mitochondriale activiteit es EpCAM-celle, wat väöl hoeger is es de metabolische activiteit vaan fibroblaste in tumorcelle in TME (Figuur 1, E en F).
(A en B) Mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) vaan glucose-opname (2-NBDG) (A) en mitochondriale activiteit vaan CD4 + T-celle (MitoTracker doonkerroed) (B) Representatieve grafieke (links) en getabuleerde gegeves (rechts), CD8 + T-celle en EpCAM + CD45-celle es tumorcelle en tumorcelle. (C) De verhouding vaan CD4 + en CD8 + celle (vaan CD3 + T celle) in ascites en tumor. (D) Aandeil vaan EpCAM + tumorcelle in ascites en tumor (CD45−). (E en F) EpCAM + CD45-tumor en EpCAM-CD45-matrix glucose-opname (2-NBDG) (E) en mitochondriale activiteit (MitoTracker doonkerroed) (F) representatieve grafieke (links) en getabuleerde data (rechts) Ascites en tumorcelle. (G) Representatieve grafieke vaan CD25, CD137 en PD1 expressie door flowcytometrie. (H en I) CD25, CD137 en PD1 expressie op CD4 + T-celle (H) en CD8 + T-celle (I). (J en K) Naïef, centraal geheuge (Tcm), effector (Teff) en effector geheuge (Tem) fenotypes gebaseerd op de expressie vaan CCR7 en CD45RO. Representatieve aafbeeldinge (links) en tabelvormige data (rechts) vaan CD4 + T-celle (J) en CD8 + T-celle (K) in ascites en tumore. P-waardes bepaold door ‘n gepaarde t-test (*P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001). De lijn representeert gematchde patiënte (n = 6). FMO, fluorescentie minus ein; MFI, mediane fluorescentieintensiteit.
Verdere analyse onthulde aandere significante versjille tusse de hoeg opgelosde fenotypische status vaan de T-cel. ‘t Geactiveerde (Figuur 1, G tot I) en effectorgeheuge (Figuur 1, J en K) in tumore zien väöl frequenter es ascites (aondeil CD3 + T-celle). Op dezelfde meneer, ‘t analysere vaan ‘t fenotype door de expressie vaan activatiemarkers (CD25 en CD137) en oetputtingsmarkers [geprogrammeerde celdoedseiwit 1 (PD1)] leet zien dat, hoewel de metabolische kenmerke vaan dees populaties aanders zien (Figuur S1, B tot E) , mer d’r gein significante metabolische versjille woorte consequent woergenome tusse natieve of geheuge-effecte (Figuur S1, F1) ICH). Dees resultate woorte bevestig door ‘t gebruuk vaan machine learning-methodes um automatisch celfenotypes touw te wijze (21), wat weijer de aanwezigheid vaan ‘n groet aontal kneukmergcelle (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) in de ascites vaan de patiënt onthulde (Figuur S2A). Onder alle geïdentificeerde celtypes leet dees myeloïde celpopulatie de hoegste glucose-opname en mitochondriale activiteit zien (Figuur S2, B tot G). Dees resultate benaodrökke de sterke metabolische versjille tösse de mierdere celtypes die in ascites en tumore bij HGSC-pasiënte weure aongetroffe.
De groetste oetdaging in ‘t begriepe vaan de metabolomische kenmerke vaan TIL is de behoefte um T-celmonsters vaan voldoende zuuverheid, kwaliteit en wieväölheid vaan tumore te isolere. Recente studies höbbe aongetoend dat sortere en kraalverriekingsmethodes gebaseerd op flowcytometrie kinne leie tot veranderinge in cellulaire metabolietprofiele (22-24). Um dit probleem te euverwinne, höbbe veer de kraalverriekingsmethode geoptimaliseerd um TIL te isolere en te isolere vaan chirurgisch geresecteerde minseleke eierstokkanker veur de analyse door LC-MS/MS (zuug Materiale en Methodes; Figuur 2A). Um de algehele impact vaan dit protocol op metabolietveranderinge te beoordeile, vergeleke veer de metabolietprofiele vaan T-celle die door gezonde donore woorte geactiveerd nao de bovestaonde kraolsjeijingsstap mèt celle die neet door kralen woorte gesjeie mer op ies bleve. Deze kwaliteitscontroleanalyse heet gebleke dat d’r ‘n hoege correlatie is tusse dees twie umstandeghede (r = 0,77), en dat de technische herhaolbaarheid vaan de groep vaan 86 metaboliete ‘n hoege herhaolbaarheid heet (Figuur 2B). Daorum kinne dees methodes nauwkeurige metabolietanalyses oetveure in celle die celtypeverriekking ondergoon, boedoor ‘t ierste hoegresolutieplatform veur ‘t identificere vaan specifieke metaboliete in HGSC weure aongeboje, boedoor lui ‘n beter begrip kriege vaan ‘t seksueel metabolismeprogramma veur celspecificiteit.
(A) Sjematisch diagram vaan magnetische kraolverrieking. Veur de analyse door LC-MS/MS, zulle de celle drie opeinvolgende rundes vaan magnetische kraolverrieking ondergoon of op ies blieve. (B) ‘t Effect vaan ‘t verriekingstype op de euvervloed aon metaboliete. ‘t Gemiddelde vaan drei metinge veur eder verriekingstype ± SE. De grieze lijn steit veur ‘n 1:1 relatie. De intra-klasse correlatie (ICC) vaan herhaolde metinge weurt in ‘t aslabel getoend. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Sjematisch diagram vaan de werkstroum vaan de metabolietanalyse vaan de patiënt. Ascites of tumore weure vaan patiënte verzameld en gecryopreserveerd. ‘n Klein deil vaan eder monster woort geanalyseerd door middel vaan flowcytometrie, terwijl de euvergebleve monsters drei rundes vaan verrieking veur CD4+, CD8+ en CD45-celle onderginge. Dees celfracties woorte geanalyseerd mit behulp vaan LC-MS/MS. (D) Heatmap vaan gestandaardiseerde metabolieteuvervloed. ‘t Dendrogram representeert Ward’s clustering vaan Euclideaonse aofstande tusse monsters. (E) Principale component analyse (PCA) vaan de metabolietkaart vaan ‘t steekproef, boebij drie replica’s vaan eder steekproef zien, monsters vaan dezelfde patiënt zien door ‘n lijn verboonde. (F) De PCA vaan ‘t metabolietprofiel vaan ‘t monster geconditioneerd op de patiënt (d.w.z. gebruukmakend vaan gedeilteleke redundantie); ‘t steekproeftype is beperk door de convexe romp. PC1, hoofcomponent 1; PC2, hoofcomponent 2.
Vervolgens höbbe we deze verriekkingsmethode toegepas um 99 metaboliete in de CD4 +, CD8 + en CD45-celfracties in de primaire ascites en tumore vaan zes HGSC-pasiënte te analysere (Figuur 2C, Figuur S3A en Tabel S3 en S4). De populatie vaan interesse maak 2% tot 70% oet vaan de oorspronkeleke groete steekproef vaan levende celle, en ‘t aondeil celle varieert hiel erg tösse patiënte. Nao ‘t sjeije vaan de krale, is de verriekde fractie vaan interesse (CD4+, CD8+ of CD45-) gemiddeld veur mie es 85% vaan alle levende celle in ‘t monster. Deze verriekingsmethode stelt us toe um celpopulaties oet minselik tumorweefselmetabolisme te analysere, wat neet meugelik is um te doen oet groete monsters. Door dit protocol te gebruke, höbbe veer bepaold dat l-kynurenine en adenosine, dees twie good gekarakteriseerde immunosuppressieve metaboliete, verheug waore in tumor T-celle of tumorcelle (Figuur S3, B en C). Daorum toene dees resultate de trouwheid en ‘t vermoge vaan ós celsjeijings- en massaspectrometrietechnologie um biologisch belangrieke metaboliete in patiëntweefsels te vinde.
Ozze analyse onthulde ouch ‘n sterke metabolische sjeiing vaan celtypes binne en tösse patiënte (Figuur 2D en Figuur S4A). In ‘t biezoonder, in vergelieking mit aandere patiënte, leet patiënt 70 versjillende metabolische kinmerke zien (Figuur 2E en Figuur S4B), wat aonguuf dat d’r substantiële metabolische heterogeiteit tusse patiënte kin zien. ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat in vergelieking mit aandere patiënte (1,2 tot 2 liter; Tabel S1), de totale wieväölheid ascites die bij patiënt 70 (80 ml) woort verzameld kleiner waor. De controle vaan inter-pasiënte heterogeiteit tijdens de hoofcomponentanalyse (beveurbeeld door ‘t gebruuk vaan gedeelteleke redundantie-analyse) toent consistente veranderinge tusse celtypes, en de celtypes en/of de micro-umgeving zien duudelik samegevoeg volgens ‘t metabolietprofiel (Figuur 2F). De analyse vaan enkele metaboliete benaodrökde dees effecte en onthulde significante versjille tusse celtypes en micro-umgeving. ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat ‘t meis extreme versjil dat weurt gezeen MNA is, wat miestal verriek is in CD45-celle en in CD4+ en CD8+ celle die de tumor infiltrere (Figuur 3A). Veur CD4 + celle is dit effek ‘t meis duujelek, en de MNA in CD8 + celle liek ouch sterk te weure beïnvlood door de umgeving. Dit is echter neet belangriek, want mer drei vaan de zes patiënte kinne weure beoordeild op tumor CD8+-scores. Neve MNA zien in versjillende soorte celle in ascites en tumore ouch aandere metaboliete die slech gekarakteriseerd zien in TIL versjillende riek (Figure S3 en S4). Daorum laote dees data un väölbelaovende set vaan immunomodulerende metaboliete zien veur wijer oonderzeuk.
(A) Genormaliseerde inhoud vaan MNA in CD4+, CD8+ en CD45-celle vaan ascites en tumor. De boxplot toont ‘t mediaan (lijn), ‘t interkwartielbereik (frame scharnier) en ‘t databereik, tot 1,5 keer ‘t interkwartielbereik (frame whisker). Zoals besjreve in Patient Materials and Methods, gebruuk de limmawaarde vaan de patiënt um de P-waarde te bepaole (*P<0,05 en **P<0,01). (B) Schematisch diagram vaan MNA-metabolisme (60). Metaboliete: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteïne; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridon-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzyme (greun): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purinenucleoside fosforylase. (C) t-SNE vaan scRNA-seq vaan ascites (gries) en tumor (roed; n = 3 patiënte). (D) NNMT-expressie in versjillende celpopulaties geïdentificeerd mit behulp vaan scRNA-seq. (E) Expressie vaan NNMT en AOX1 in SK-OV-3, minseleke embryonische nier (HEK) 293T, T-celle en MNA-behandelde T-celle. De gevouwe expressie weurt getoend relatief aon SK-OV-3. ‘t Expressiepatroon mit SEM weurt getoend (n = 6 gezonde donore). Ct-waardes groeter es 35 weure besjouwd es ondetecteerbaar (UD). (F) Expressie vaan SLC22A1 en SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, T-celle en T-celle behandeld mit 8mM MNA. De gevouwe expressie weurt getoend relatief aon SK-OV-3. ‘t Expressiepatroon mit SEM weurt getoend (n = 6 gezonde donore). Ct-waardes groeter es 35 weure besjouwd es ondetecteerbaar (UD). (G) Cel-MNA-inhoud in geactiveerde gezonde donor-T-celle nao 72 oor incubatie mit MNA. ‘t Expressiepatroon mit SEM weurt getoend (n = 4 gezonde donore).
MNA weurt geproduceerd door de methylgroep vaan S-adenosyl-1-methionine (SAM) nao nicotinamide (NA) euver te bringe door nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figuur 3B). NNMT weurt euverexpresseerd in ‘n versjeijenheid aon minseleke kankers en is geassocieerd mit proliferatie, invasie en metastase (25-27). Um de bron vaan MNA in T-celle in TME beter te begriepe, gebruukde veer scRNA-seq um de expressie vaan NNMT in celtypes in de ascites en tumore vaan drei HGSC-pasiënte te karakterisere (Tabel S5). Analyse vaan ongeveer 6.500 celle leet zien dat in ascites en tumorumgevinge, NNMT-expressie beperk waor tot de vermeinde fibroblast- en tumorcelpopulaties (Figuur 3, C en D). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat d’r gein obvious NNMT-expressie is in ‘n populatie die PTPRC (CD45 +) expresseert (Figuur 3D en Figuur S5A), wat aonguuf dat de MNA dee in ‘t metabolietspectrum is gedetecteerd is geïntroduceerd in T-celle. De expressie vaan aldehyde oxidase 1 (AOX1) zet MNA um in 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) of 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); Figuur 3B) is ouch beperk tot de populatie vaan fibroblaste die COL1A1 expressere (Figuur S5A), wat same aongief dat T-celle ‘t vermoge vaan conventionele MNA-metabolisme neet höbbe. ‘t Expressiepatroon vaan dees MNA-gerelateerde gene woort gecontroleerd met behulp vaan ‘n twiede onaafhankeleke celgegevensset vaan ascites vaan HGSC-pasiënte (Figuur S5B; n = 6) (16). Daoneve leet kwantitatieve polymerasekettingreaksie (qPCR) analyse vaan gezonde donor-T-celle behanjeld mèt MNA zien dat in vergelieking mèt controle SK-OV-3 eierstoktumorcelle, NNMT of AOX1 bekans neet tot expressie waor (Figuur 3E). Dees oonverwachde resultate wieze op dat MNA kin weure aafgesjeie vaan fibroblaste of tumore nao naburige T-celle in TME.
Alhoewel de kandidate de familie vaan organische kationtransporters 1 tot 3 (OCT1, OCT2 en OCT3) umvatte die door de oplosbare drager 22 (SLC22) femilie (SLC22A1, SLC22A2 en SLC22A3) zien gecodeerd, zien de potentiële transporters vaan MNA nog neet gedefinieerd (28) . QPCR vaan mRNA vaan gezonde donor-T-celle toonde liege expressieniveaus vaan SLC22A1 mer ondetecteerbare niveaus vaan SLC22A2, wat bevestigde dat ‘t eerder in de literatuur waor gerapporteerd (Figuur 3F) (29). In taegesjtelling, de SK-OV-3 eierstoktumorcellijn had hoege niveaus vaan allebei transporters oet (Figuur 3F).
Um de meugelikheid te teste dat T-celle ‘t vermoge höbbe um vreem MNA te absorbere, woorte gezonde donor-T-celle 72 oor in de aonwezigheid vaan versjèllende concentraties vaan MNA gekweek. In de aafwezigheid vaan exogene MNA kin de cellulaire inhoud vaan MNA neet weure gedetecteerd (Figuur 3G). Geactiveerde T-celle behanjeld mit exogene MNA toonde echter un dosis-afhankelike touwnaome in MNA-inhoud in de celle, tot 6 mM MNA (Figuur 3G). Dit resultaat gief aon dat, ondanks ‘t liege niveau vaan transporterexpressie en ‘t gebrek aon ‘t hoof-enzym dat verantweurdelek is veur intracellulaire MNA-metabolisme, TIL nog altied MNA kin opnumme.
‘t Spectrum vaan metaboliete in T-celle vaan patiënte en in vitro MNA-absorptie-experimente vergroete de meugelikheid dat kanker-geassocieerde fibroblaste (CAF) MNA aofsjeie en tumorcelle ‘t fenotype en functie vaan TIL kinne regulere. Um ‘t effek vaan MNA op T-celle te bepaole, woorte gezonde donor-T-celle in vitro geactiveerd in de aonwezigheid of aofwezigheid vaan MNA, en woorte hun proliferatie en cytokineproductie beoordeild. Nao 7 daog vaan ‘t toevoege vaan MNA in de hoegste dosis, waor ‘t aontal verdubbeling vaan de bevolking gemaoteg verminderd, onderwieles de krach bij alle doses bleef behawwe (Figuur 4A). Daoneve resulteerde de behandeling vaan exogene MNA in ‘n touwnaome in ‘t aondeil CD4 + en CD8 + T-celle die tumornecrosefactor-α (TNFα; Figuur 4B) expresseerde. Daoretege waor de intracellulaire productie vaan IFN-γ significant verminderd in CD4 + T-celle, mer neet in CD8 + T-celle, en d’r waor gein significante verandering in interleukine 2 (IL-2; Figuur 4, C en D). Daorum leet ‘n enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) vaan supernatante vaan dees MNA-behandelde T-celkweek ‘n significante touwnaome in TNFα, ‘n aofname in IFN-γ en gein verandering in IL-2 zien (Figuur 4, E tot G). . De aafname vaan IFN-γ gief aon dat MNA ‘n rol kin spele in ‘t remme vaan de anti-tumoractiviteit vaan T-celle. Um ‘t effek vaan MNA op T-celle gemedieerde cytotoxiciteit te simulere, were chimerische antigeenreceptor T (FRα-CAR-T) celle die zich riechte op folaatreceptor α en CAR-T (GFP) gereguleerd door green fluorescerend eiwit (GFP) -CAR-T) celle geproduceerd door gezonde donorperifere blood mononucleaire celle (PBMC). CAR-T-celle woorte 24 oor gekweek in de aanwezigheid vaan MNA, en vervolgens samegekweek mit minseleke SK-OV-3 eierstoktumorcelle die folaatreceptor α expresseerde in ‘n effector-doelwitverhouding vaan 10:1. MNA-behandeling resulteerde in ‘n significante afname in de doejende activiteit vaan FRα-CAR-T-celle, wat vergeliekbaar waor mit FRα-CAR-T-celle die behandeld woorte mit adenosine (Figuur 4H).
(A) Totaal aantal levensvatbare celle en populatieverdubbeling (PD) direk vaan kweek op daag 7. De staafgrafiek representeert ‘t gemiddelde + SEM vaan zes gezonde donore. Vertegenwoordig data vaan op z’n mins n = 3 oonaofhenkeleke experiminte. (B tot D) CD3/CD28 en IL-2 woorte gebruuk um T-celle te activere in hun respectievelike MNA-concentraties veur 7 daog. Veur de analyse woorte celle 4 oor lang gestimuleerd mit PMA/ionomycine mit GolgiStop. TNFα (B) expressie in T-celle. Veurbeeldbeeld (links) en tabelgegevens (rechts) vaan TNFα-expressie in levende celle. IFN-γ (C) en IL-2 (D) expressie in T-celle. De expressie vaan cytokine woort gemaete door flowcytometrie. De staafgrafiek steit veur ‘t gemiddelde (n = 6 gezonde donore) + SEM. Gebruik een-weg-analyse vaan variantie en herhaolde metinge (*P<0,05 en **P<0,01) um de P-waarde te bepaole. Vertegenwoordig data vaan op z’n mins n = 3 oonaofhenkeleke experiminte. (E tot G) CD3/CD28 en IL-2 woorte gebruuk um T-celle te activere in hun respectievelike MNA-concentraties veur 7 daog. ‘t Medium woort veur en nao 4 oor PMA/ionomycine-stimulatie verzameld. De concentraties vaan TNFα (E), IFN-γ (F) en IL-2 (G) woorte gemete door ELISA. De staafgrafiek representeert ‘t gemiddelde (n = 5 gezonde donore) + SEM. P-waarde bepaold door behulp vaan een-weg-analyse vaan variantie en herhaolde metinge (*P<0,05). De stippellijn gief de detectiegrens vaan de detectie aon. (H) Cellyse-assay. FRα-CAR-T- of GFP-CAR-T-celle woorte 24 oor lang aongepas mit adenosine (250μM) of MNA (10 mM), of neet behandeld (Ctrl). ‘t Percentaasj doede vaan SK-OV-3-celle woort gemaete. P-waarde bepaold door Welch t-test (*P<0,5 en **P<0,01).
Um un mechanistisch begrip te kriege vaan MNA-afhankelike TNFα-expressieregulering, woorte de veranderinge in TNFα mRNA vaan MNA-behandelde T-celle beoordeild (Figuur 5A). Gezonde donor-T-celle die mit MNA woorte behandeld, leete un twievoudige touwnaome in TNFα-transcriptieniveaus zien, wat aonguuf dat MNA aafhankelik is vaan TNFα-transcriptieregulering. Um dit meugeleke regelgevende mechanisme te oonderzeuke, woorte twie bekinde transcriptiefactore die TNFα regulere, naomelek geactiveerde T-celnucleaire factor (NFAT) en specifiek eiwit 1 (Sp1), beoordeild es reactie op MNA-binding aon de proximale TNFα-promotor ( 30). De TNFα-promotor bevat 6 geïdentificeerde NFAT-bindingsplaatse en 2 Sp1-bindingsplaatse, die op ein locatie euverlappe [-55 basenparen (bp) vaan de 5'cap] (30). Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) leet zien dat bij ‘t behandele mit MNA de binding vaan Sp1 aon de TNFα-promotor drievoudig touwnaom. De incorporatie vaan NFAT naom ouch touw en benaderde ‘t belang (Figuur 5B). Dees data wieze op dat MNA de expressie vaan TNFα via Sp1-transcriptie reguleert, en in mindere maote de expressie vaan NFAT.
(A) Vergeleke mit T-celle die gekweek woorte zoonder MNA, veranderde de vouwvoudige expressie vaan TNFα in T-celle die mèt MNA woorte behanjeld. ‘t Expressiepatroon mit SEM weurt getoend (n = 5 gezonde donore). Vertegenwoordig data vaan op z’n mins n = 3 oonaofhenkeleke experiminte. (B) De TNFα-promotor vaan T-celle behandeld mèt of zoonder 8 mM MNA naodat NFAT en Sp1 woorte gecombineerd mèt (Ctrl) en PMA/ionomycine-stimulatie veur 4 oor. Immunoglobuline G (IgG) en H3 woorte gebruuk es negatieve en positieve controles veur immunoprecipitatie, respectievelik. De kwantificering vaan ChIP leet zien dat de binding vaan Sp1 en NFAT aon de TNFα-promotor in MNA-behandelde celle versjèllende kiere touwnaom in vergelieking mèt de controle. Vertegenwoordig data vaan op z’n mins n = 3 oonaofhenkeleke experiminte. P-waarde bepaold door meerdere t-teste (*** P <0,01). (C) In vergelieking mit de ascites vaan HGSC, leete T-celle (neet-cytotoxisch) ‘n verhoegde expressie vaan TNF in de tumor zien. De kleure vertegenwoordige versjillende patiënte. De getoende celle zien willekeurig bemonsterd nao 300 en gejitterd um euverteikening te beperke (** Padj = 0,0076). (D) Veurgestèld model vaan MNA veur eierstokkanker. MNA weurt geproduceerd in tumorcelle en fibroblaste in TME en weurt opgenome door T-celle. MNA vergroet de binding vaan Sp1 aon de TNFα-promotor, wat leidt tot ‘n verhoogde TNFα-transcriptie en TNFα-cytokineproductie. MNA veroorzaak ouch ‘n aofname in IFN-γ. Remming vaan de T-celfunctie leidt tot ‘n verminderde doedvermoge en ‘n versnelde tumorgreuj.
Volgens versjlage heet TNFα anti-tumor- en antitumor-effecte veur- en achterkant, mer ‘t heet ‘n bekinde rol in ‘t bevordere vaan de greuj en metastase vaan eierstokkanker (31-33). Volgens versjlage is de concentratie vaan TNFα in ascites en tumorweefsel bij patiënte mit eierstokkanker hoeger es die in goedaardig weefsel (34-36). Wat mechanisme betröf, kin TNFα de activatie, functie en proliferatie vaan witte bloodcelle regulere en ‘t fenotype vaan kaankercelle verandere (37, 38). In euvereinstumming mit dees bevindinge leet ‘n differensjele genexpressieanalyse zien dat TNF significant waor gereguleerd in T-celle in tumorweefsel in vergelieking mit ascites (Figuur 5C). De touwnaome in TNF-expressie waor allein dudelik in T-celpopulaties mit un neet-cytotoxisch fenotype (Figuur S5A). Samevattend, dees data ondersteune de opvatting dat MNA dubbele immunosuppressieve en tumorbevorderende effecte heet in HGSC.
Fluorescerende etikettering gebaseerd op flowcytometrie is de belangriekste methode gewore veur ‘t bestudere vaan TIL-metabolisme. Dees studies höbbe aongetoend dat in vergelieking mit perifere bloodlymfocyte of T-celle vaan secundaire lymfoïde organe, TIL vaan muis en minse ‘n hoegere neiging höbbe um glucose op te numme (4, 39) en ‘t geleidelek verluus vaan mitochondriale functie (19, 40). Alhoewel ver soortgelieke resultate höbbe gezeen in dit oonderzeuk, is de belangriekste ontwikkeling um de metabolisme vaan tumorcelle en TIL oet ‘tzelfde geresecteerde tumorweefsel te vergelieke. In euvereinstumming mit sommige vaan dees veurige rapporte höbbe tumorcelle (CD45-EpCAM +) oet ascites en tumore ‘n hoeger glucose-opname es CD8 + en CD4 + T-celle, wat bewies dat de hoege glucose-opname vaan tumorcelle kin weure vergeleke mèt T-celle. ‘t Concep vaan T-celconcurrentie. TME. De mitochondriale activiteit vaan tumorcelle is echter hoeger es die vaan CD8 + T-celle, mer de mitochondriale activiteit is geliek aon die vaan CD4 + T-celle. Dees resultate versterke ‘t opkommende thema dat oxidatief metabolisme belangriek is veur tumorcelle (41, 42). Ze suggerere ouch dat CD8 + T-celle vatbaarder kinne zien veur oxidatieve dysfunctie es CD4 + T-celle, of dat CD4 + T-celle andere koolstofbronne es glucose kinne gebruke um mitochondriale activiteit te behawwe (43, 44). D’r mot opgemerk weure dat ver gein versjil in glucose-opname of mitochondriale activiteit tusse CD4 + T-effectore, T-effectorgeheuge en T-centrale geheugecelle in ascites höbbe gezeen. Op dezelfde meneer heet de differentiatietoestand vaan CD8 + T-celle in tumore niks te make mit veranderinge in glucose-opname, wat ‘t significante versjil tösse T-celle die in vitro gekweek zien en minseleke TIL in vivo benaodrök (22). Dees observaties woorte ouch bevestig door ‘t gebruuk vaan onbeveuroordeilde automatische celpopulatietoewiezing, wat weijer onthulde dat CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + celle mit ‘n hoegere glucose-opname en mitochondriale activiteit es tumorcelle veurkomme mer ‘n metabolische actieve celpopulatie höbbe. Dees populatie kin de vermeinde subpopulatie vaan myeloïde suppressorcelle of plasmacytoïde dendritische celle vertegenwoordige die in de scRNA-seq-analyse zien geïdentificeerd. Alhoewel dees allebei zien gerapporteerd in minseleke eierstoktumore [45], höbbe ze nog altied nuudig.
Alhoewel op flowcytometrie gebaseerde methodes de algemeine versjille in glucose en oxidatief metabolisme tusse celtypes kinne verdudelike, zien de perceize metaboliete geproduceerd door glucose of aandere koolstofbronne veur mitochondriale metabolisme in TME nog neet bepaold. ‘t Toewieze vaan de aanwezigheid of aofwezigheid vaan metaboliete aon ‘n bepaolde TIL-subset vereis ‘t zuivere vaan de celpopulatie oet ‘t oetgesneje weefsel. Daorum kin ós celverriekingsmethode in combinatie mit massaspectrometrie inzich geve in de metaboliete die versjillend verriek zien in T-celle en tumorcelpopulaties in euvereinkomstige patiëntmonsters. Alhoewel dees methode veurdeile heet ten opziechte vaan fluorescentie-geactiveerde cellsortere, kinne bepaolde metabolietbibliotheke weure beïnvlood door hun inherènte stabiliteit en/of snelle umzetsnelheid (22). Desalniettemin waor ós methode in staot um twie erkinde immunosuppressieve metaboliete, adenosine en kynurenine, te identificere, umtot ze sterk versjille tusse steekproeftypes.
Ozze metabolomische analyse vaan tumore en TIL-subtypes gief mie inzich in de rol vaan metaboliete in eierstok TME. Iers, door flowcytometrie te gebruke, bepaolde veer dat d’r gein versjil waor in mitochondriale activiteit tusse tumore en CD4 + T-celle. LC-MS/MS-analyse onthulde echter significante veranderinge in ‘t euvervloed aan metaboliete oonder dees populaties, wat aonguuf dat conclusies euver TIL-metabolisme en zien algehele metabolische activiteit zorgvuldige interpretatie vereise. Ten twiede is MNA ‘t metaboliet mit ‘t groetste versjil tusse CD45-celle en T-celle in ascites, neet in tumore. Daorum kinne compartimentalisatie en tumorlocatie versjèllende effecte höbbe op TIL-metabolisme, wat de meugeleke heterogeiteit in ‘n bepaolde micro-umgeving benaodrök. Ten derde is de expressie vaan ‘t MNA-producerende enzym NNMT veurnaomelek beperk tot CAF, wat in mindere maote tumorcelle is, mer detecteerbare MNA-niveaus weure woergenome in tumor-aafgeleide T-celle. De euverexpressie vaan NNMT in eierstok CAF heet ‘n bekind kankerbevorderend effek, deils door de bevordering vaan CAF-metabolisme, tumorinvasie en metastase (27). Alhoewel ut algehele niveau vaan TIL gemaoteg is, is de expressie vaan NNMT in CAF nauw verboonde aon ut mesenchymaal subtype Cancer Genome Atlas (TCGA), wat geassocieerd weurt mit slechte prognose (27, 46, 47). Oeteindelik is de expressie vaan ‘t enzym AOX1 dat verantweurdelek is veur de aafbraok vaan MNA ouch beperk tot de CAF-populatie, wat aongief dat T-celle ‘t vermoge neet höbbe um MNA te metabolisere. Dees resultate ondersteune ‘t idee dat, hoewel weijer werk nuudig is um dees bevinding te verifiëre, hoege niveaus vaan MNA in T-celle de aanwezigheid vaan ‘n immunosuppressieve CAF-micro-umgeving kinne aongeve.
Gezeen ‘t liege expressieniveau vaan MNA-transporters en de oondetecteerbare niveaus vaan belangrieke eiwitte die betrokke zien in ‘t MNA-metabolisme, is de aonwezigheid vaan MNA in T-celle oonverwach. Noch NNMT noch AOX1 kooste weure gedetecteerd door scRNA-seq-analyse en geriechte qPCR vaan twie onaafhankeleke cohortes. Dees resultate wieze op dat MNA neet door T-celle weurt gesynthetiseerd, mer geabsorbeerd door de umringende TME. In vitro-experiminte toene aan dat T-celle de neiging höbbe um exogene MNA te verzamele.
Ozze in vitro studies höbbe aongetoend dat exogene MNA de expressie vaan TNFα in T-celle induceert en de binding vaan Sp1 aon de TNFα-promotor verbetert. Alhoewel TNFα zoewel anti-tumor- es anti-tumorfuncties heet, kin TNFα bij eierstokkanker de greuj vaan eierstokkanker bevordere (31-33). De neutralisering vaan TNFα in eierstoktumorcelkweek of de eliminatie vaan TNFα-signaal in moesmodelle kin de TNFα-gemedieerde ontstekingscytokineproductie verbetere en de tumorgreuj remme (32, 35). Daorom, in dit geval, kin TME-aafgeleide MNA es pro-inflammatoire metaboliet fungere via un TNFα-afhankelik mechanisme via de autocrine lus, en zoedoende de optrejje en verspreijing vaan eierstokkanker bevordert (31). Op basis vaan dees meugelekheid weurt TNFα-blokkade bestudeerd es ‘n potentieel therapeutisch middel veur eierstokkanker (37, 48, 49). Daoneve beperk MNA de cytotoxiciteit vaan CAR-T-celle veur eierstoktumorcelle, wat weijer bewies lievert veur MNA-gemedieerde immuunsupressie. Same suggerere dees resultate un model boe-in tumore en CAF-celle MNA in extracellulaire TME aofsjeije. Door (i) door TNF geïnduceerde greujstimulatie vaan eierstokkanker en (ii) door MNA geïnduceerde cytotoxische activiteit vaan T-cel, kin dit ‘n dubbel tumoreffek höbbe (Figuur 5D).
Concluderend, door ‘n combinatie vaan snelle celverrieking, inkelcelsequensjering en metabolische profilering toe te passe, onthulde dit oonderzeuk de enorme immunometabolomische versjille tösse tumore en ascitescelle bij HGSC-pasiënte. Deze oetgebreide analyse leet zien dat d’r versjille zien in glucose-opname en mitochondriale activiteit tösse T-celle, en identificeerde MNA es ‘n neet-cel autonoom immuunregulerende metaboliet. Dees data höbbe ‘n invlood op de meneer boe-op TME de T-celmetabolisme in minseleke kanker beïnvlood. Alhoewel de directe concurrentie veur voedingstoffe tusse T-celle en kankercelle is gerapporteerd, kinne metaboliete ouch fungere es indirecte regelgevers um tumorprogressie te bevordere en eventueel endogene immuunresponse te oonderdrökke. De weijer besjrieving vaan de functionele rol vaan dees regelgevende metaboliete kin alternatieve strategieën openstelle veur ‘t verbetere vaan de anti-tumor immuunrespons.
Patiëntmonsters en klinische data woorte verkrege via de BC-kankertumorweefselrepository gecertificeerd door ‘t Canadian Tissue Repository Network. Volgens ‘t protocol dat door ‘t BC Cancer Research Ethics Committee en de Universiteit vaan British Columbia (H07-00463) is goodgekäörd, höbbe alle exemplare en klinische gegeves vaan patiënte geïnformeerde gesjreve toestemming verkrege of formeel hun toestumming aafgeweze. De monsters were opgeslage in de gecertificeerde BioBank (BRC-00290). Gedetailleerde patiëntkenmerke zien te zien in tabelle S1 en S5. Veur cryopreservatie weurt ‘n scalpel gebruuk um ‘t tumormonster vaan de patiënt mechanisch te ontbinde en ‘t vervolgens door ‘n 100-micron filter te duuje um ‘n inkelcelsuspensie te kriege. De ascites vaan de patiënt woort gecentrifugeerd bij 1500 rpm veur 10 minute bij 4°C um de celle te pelletere en ‘t supernatant te verwijdere. Celle verkriege vaan tumor en ascites woorte gecryopreserveerd in 50% hitte-geïnactief minselik AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) en 10% dimethylsulfoxide. Dees gepreserveerde enkelcelsuspensies woorte oontdooje en gebruuk veur metabolomie en metabolietbepaoling, besjreve hei-oonder.
‘t Complete medium besteit oet 0,22 μm gefilterd 50:50 aongevöld RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) aongevöld mit 10% hitte-geïnactief minselik AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penicilline Streptomycine (PenStrep) oplossing (Thermo Fisher Scientific) en 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) weurt aongevuld mit 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) en 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). De kleuringsbuffer vaan de flowcytometer bestoont oet 0,22 μm gefilterd fosfaat gebufferde zoutvloeistof (PBS; Invitrogen) aongevöld mit 3% hitte-geïnactief AB minselik serum (Sigma). De celverriekingsbuffer is samengesjtèld oet 0,22 μm gefilterd PBS en weurt aongevöld mit 0,5% wermte-geïnactiveerd minselik AB-serum (Sigma-Aldrich).
In 37°C volledig medium woorte celle gedurende 30 minute gekleurd mit 10 nM MT DR en 100 μM 2-NBDG. Daonao woorte de celle gekleurd mit levensvatbaarheidskleurstof eF506 bij 4°C veur 15 minute. Hersuspendeer de celle in FC Block (eBioscience) en Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), verdun in de kleuringsbuffer vaan de flowcytometer (volges de instructies vaan de fabrikant) en incubeer 10 minute bij kamertemperatuur. Kleur de celle mit un set antiliechame (tabel S2) in stroumcytometriekleuringbuffer bij 4°C gedurende 20 minute. Hersuspendere de celle in flowcytometrie kleuringsbuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuratie) veur de analyse. Gebruik SpectroFlo en FlowJo V10 um de data vaan celle te analysere en gebruuk GraphPad Prism 8 um de data te make. De mediane fluorescentieintensiteit (MFI) vaan 2-NBDG en MT DR woort log-genormaliseerd, en vervolgens woort ‘n gepaarde t-test gebruuk veur statistische analyse um rekening te hawwe mit gematchde patiënte. Verwijder alle populaties mit minder es 40 gebeurtenisse oet de analyse; voer ‘n MFI-waarde vaan 1 in veur alle negatieve waarde veurtot statistische analyse en datavisualisatie oetveurt.
Um de handmatige gatingstrategie vaan ‘t bovestaonde procespaneel aon te völle, gebruukde veer de volledige annotatie door de vormbeperkingsboum (FAUST) (21) um celle automatisch touw te wijze aon de populatie nao ‘t eliminere vaan doeje celle in FlowJo. We behere de oetvoer handmatig um populaties same te voge die verkierd lieke te zien toegeweze (door PD1+ te combinere mit PD1-tumorcelle) en behawwe populaties. Eeder monster bevat gemiddeld mie es 2% celle, veur in totaal 11 populaties.
Ficoll gradient density centrifugatie woort gebruuk um PBMC te sjeije vaan leukocyte separatieprodukte (STEMCELL Technologies). CD8 + T-celle woorte geïsoleerd oet PBMC mit behulp vaan CD8 MicroBeads (Miltenyi) en oetgebreid in complete medium mit behulp vaan TransAct (Miltenyi) veur 2 weke volgens de instructies vaan de fabrikant. De celle woorte 5 daag in ‘n volledig medium mit IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) laote staon en vervolgens herstimuleerd mit TransAct. Op daag 7, volgens de instructies vaan de fabrikant, woorte minseleke CD45 MicroBeads (Miltenyi) gebruuk um celle in drei opeinvolgende rundes te verrieke. De celle woorte gealiquoteerd veur stroumcytometrie-analyse (zoe wie heibove besjreve) en ein miljoen celle woorte drei kier ge-aliquoteerd veur LC-MS/MS-analyse. De monsters woorte verwèrk door LC-MS/MS zoe wie hei-oonder besjreve. Ver sjatte de ontbrekende metabolietwaerde mit un ionoontal vaan 1.000. Eder steekproef weurt genormaliseerd door ‘t totaal ionnummer (TIC), logaritmisch umgerekend en automatisch genormaliseerd in MetaboAnalystR veur de analyse.
De enkelcelsuspensie vaan eder patiënt woort ontdooje en gefilterd door ‘n filter vaan 40 μm in ‘t volledig medium (zoe wie heibove besjreve). Volgens ‘t protocol vaan de fabrikant woorte drei opeinvolgende rundes vaan positieve selèctie door magnetische kraolsjeiing met behulp vaan MicroBeads (Miltenyi) gebruuk um de monsters veur CD8+, CD4+ en CD45-celle (op ies) te verrieke. Kort samegevat, de celle weure hersuspendeerd in celverriekkingsbuffer (zoe wie heibove besjreve) en getèld. De celle woorte 15 minute bij 4°C geïncubeerd mit minseleke CD8-kraole, minseleke CD4-kraole of minseleke CD45-kraole (Miltenyi) en vervolgens gewasse mit celverriekingsbuffer. ‘t Monster weurt door de LS-kolom (Miltenyi) gepasseerd en de positieve en negatieve breuke weure verzameld. Um de doer te verkorte en de cellherstelstap te maximalisere, weurt de CD8-fractie vervolgens gebruuk veur de twiede runde vaan CD4+-verriekking, en de CD4-fractie weurt gebruuk veur de dao-op volgende CD45-verrieking. Hool de oplossing op ies gedurende ut ganse sjeiingsproces.
Um monsters veur te bereie veur metabolietanalyse, woorte de celle einmaol gewasse mit ieskawwe zaajtoplossing, en 1 ml 80% methanol woort aon eder monster toegeveug, vervolgens gevortex en snel bevrore in vloeibaar stikstof. De monsters woorte oonderworpe aan drie vries-ontdooicycli en gecentrifugeerd mit 14.000 rpm veur 15 minute bij 4°C. ‘t Supernatant mit de metaboliete weurt verdamp tot ‘t druug is. De metaboliete woorte weer opgelos in 50 μl vaan 0,03% mierzuur, gevortexd um te menge en vervolgens gecentrifugeerd um puin te verwijdere.
Extrahere metaboliete zoewie heibove besjreve. Breng ‘t supernatant euver nao ‘n hoegprestatie vloeistofchromatografiefles veur metabolomisch oonderzeuk. Gebruik un willekeurig behandelingsprotocol um eder monster te behandele mit un vergeliekbaar aantal celle um batch-effecte te veurkómme. Ver höbbe un kwalitatieve beoordeiling oetgeveurd vaan globale metaboliete die eerder waor gepubliceerd op de AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Chromatografische analyse en piekoppervlakteintegratie woorte oetgeveurd mit behulp vaan MultiQuant versie 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
‘n Ionetelling vaan 1000 woort gebruuk um de oontbrekende metabolietwaarde te sjatte, en de TIC vaan eder monster woort gebruuk um ‘t genormaliseerde piekgebeed vaan eder gedetecteerde metaboliet te berekene um veranderinge te corrigere die door de instrumintele analyse oet de monsterverwèrking woorte geïntroduceerd. Naodat TIC is genormaliseerd, weurt MetaboAnalystR(51) (standaardparameter) gebruuk veur logaritmische umzètting en automatische normlijnsjaoling. We gebruukde PCA mit veganistische R-pakket um verkinnende analyses oet te veure vaan metabolomversjèlle tusse steekproeftypes, en gebruukde gedeelteleke redundantieanalyse um patiënte te analysere. Gebruik de Ward-methode um un heatmap-dendrogram te make um de Euclideaonse aafsjtand tusse monsters te clustere. We gebruukde limma (52) op gestandaardiseerde metaboliete-euvervloed um versjillende euvervloedige metaboliete in ‘t ganse celtype en micro-umgeving te identificere. Um de verklaoring te vereenvoudige, gebruuke ver de groepsgemiddelde parameter um ut model te specificere, en besjouwe ver de celtypes in de micro-umgeving es eder groep (n = 6 groepe); veur de significantietest, höbbe veer drei herhaolde metinge oetgeveurd veur eder metaboliet. Um valse replicatie te veurkomme, woort de patiënt opgenome es ‘n obstakel in ‘t limma-ontwerp. Um de versjille in metaboliete tösse versjèllende patiënte te controlere, höbbe veer ‘t limmamodel op ‘n vaste meneer aongepas boe-oonder patiënte. We rapportere de beteikenis vaan ‘t veurgespecificeerde contrast tusse ‘t celtype en de micro-umgeving vaan Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-correctie).
Nao vigor-verrieking met behölp vaan Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% levensvatbaarheid), woort single-cell transcriptome-sequensjering oetgeveurd op de totale levende bevrore ascites- en tumormonsters met behölp vaan un 10x 5′genexpressieprotocol. Vief gevalle mit bijpassende tumore en ascites woorte geanalyseerd, hoewel de liege levensvatbaarheid vaan ein tumormonster de opnaome devaan veurkaom. Um mierdere selècties vaan patiënte te bereike, höbbe veer de monsters vaan eder patiënt in de baone vaan de 10x chroomcontroller gecombineerd en de ascites en de tumorlocaties apaart geanalyseerd. Nao sequensjering [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genoom; ‘n gemiddelde vaan 73.488 en 41.378 lezinge per cel veur tumor en ascites respectievelik]], gebruukde veer CellSNP en Vireo (53) (gebaseerd op CellSNP as De gemeinsjappeleke minseleke SNP (VCF) verliend door GRCh38 krijg ‘n donoridentiteit touwgeweze. neet-toegeweze celle en celle geïdentificeerd es duplexe en euvereinkomstige donore tusse ascites en tumormonsters (54) behawwe op basis vaan deze taak, behawwe veer drei gevalle mit euvervloedige celvertegenwoordiging in de tumor en ascites veur downstream-analyse Nao ‘t oetveure vaan ‘n massafiltratiestap in de scater (55) en scran (56) Bioconductor, leverde veer deze verpakkingscelle op. (2792 en 4183 celle vaan tumor en ascites, respectievelik) veur analyse We gebruuke de igraph’s (57) Louvain clustering vaan ‘t gedeelde naobersnetwerk (SNN) gebaseerd op de Jaccard-aofstand tot de clustercelle door expressie. celle were gedefinieerd door de expressie vaan CD8A en GZMA, mit oetzoondering vaan subclusters mit ‘n liege ribosomale eiwitexpressie.
PBMC woorte gesjeie vaan leukocyte-sjeiingsprodukte (STEMCELL Technologies) door Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugatie. CD3 + celle woorte geïsoleerd oet PBMC met behulp vaan CD3 kralen (Miltenyi). In de aanwezigheid of aafwezigheid vaan MNA woorte CD3+-celle geactiveerd mit plaat-gebonde CD3 (5μg/ml), oplosbare CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukine). Op de lètste daag vaan oetbreiing woorte de levensvatbaarheid (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) en proliferatie (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) beoordeild door flowcytometrie. Evalueer de effectorfunctie door celle te stimulere mit PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1μg/ml) mit GolgiStop gedurende 4 oor, en monitoreer CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) en TNFα-fluoresceinsothianat (TCb1) BD). Stimuleer qPCR- en ChIP-celle mit PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1μg/ml) gedurende 4 oor. De ELISA-supernatant woort veur en nao stimulatie mit PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1 μg/ml) gedurende 4 oor verzameld.
Volg ‘t protocol vaan de fabrikant um RNA te isolere met behulp vaan RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gebruik QIAshredder (QIAGEN) um ‘t steekproef te homogenisere. Gebruik ‘n high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) um complementair DNA (cDNA) te synthetisere. Gebruik TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) um de genexpressie te kwantificere (volgens ‘t protocol vaan de fabrikant) mit de volgende probes: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427555m1 (AOX1), Hs00427555S (A12A) Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphaat off Hydrostof (GAPDH)] en Hs01010726_m1 (SLC22A2). De monsters woorte oetgeveurd op ‘t StepOnePlus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) in de MicroAmp fast optical 96-well reactionplate (Applied Biosystems) mit MicroAmp optische film. Iedere Ct-waarde die 35 euversjrijf weurt besjouwd es baove de detectiedrempel en weurt gemarkeerd es neet-detecteerbaar.
Voer ChIP oet wie eerder besjreve (58). Kort samegevat, de celle woorte behandeld mit formaldehyde (eindconcentratie 1,42%) en 10 minute bij kamertemperatuur geïncubeerd. Gebruuk ‘n aangevulde zwellingsbuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl en 0,1% NP-40) op ies veur 10 minute, en suspendeer daonao weer in immunoprecipitatiebuffer zoe wie besjreve (58 ). ‘t Monster woort vervolgens gesoniceerd mit de volgende cycli: 10 cycli (20 pulse vaan 1 seconde) en ‘n statische tied vaan 40 seconde. Incubeer ChIP-grade immunoglobuline G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) en SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antiliechame mit ‘t monster bij 4°CC sjud euvernach. Incubeer de eiwit A-krale (Thermo Fisher Scientific) mit ‘t monster bij 4°C mit ‘n zachte sjudde gedurende 1 oer, gebruuk daonao chelex-krale (Bio-Rad) um ‘t DNA te verrieke en gebruuk de proteïnase K (Thermo Fisher) veur de spijsvertering vaan eiwitte. TNFα-promotor woort gedetecteerd door PCR: veurwaarts, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; in taegesjtelling, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp product). De aafbeeldinge woorte geproduceerd door Image Lab (Bio-Rad) en gekwantificeerd mit behulp vaan ImageJ-software.
‘t Supernatant vaan de celkweek woort verzameld wie heibove besjreve. De bepaoling woort oetgeveurd volgens de procedures vaan de fabrikant vaan de minseleke TNFα ELISA-kit (Invitrogen), de minseleke IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) en de minseleke IFN-γ ELISA-kit (Abcam). Volges ‘t protocol vaan de fabrikant woort ‘t supernatant 1:100 verdund um TNFα en IL-2 te detectere en 1:3 um IFN-γ te detectere. Gebruik EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) um absorptie op 450 nm te mete.
PBMC woorte gesjeie vaan leukocyte-sjeiingsprodukte (STEMCELL Technologies) door Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugatie. CD3 + celle woorte geïsoleerd oet PBMC met behulp vaan CD3 kralen (Miltenyi). In de aanwezigheid of aafwezigheid vaan MNA woorte CD3+-celle gedurende 3 daag geactiveerd mit plaat-gebonde CD3 (5μg/ml), oplosbare CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukine). Nao 3 daag woorte de celle verzameld en gewasse mit 0,9% zoutvloeistof, en de pellet woort snel bevrore. Celtèlling woort oetgeveurd door flowcytometrie (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuratie) mit behulp vaan 123count eBeads.
Extrahere metaboliete zoewie heibove besjreve. ‘t Gedroogde extract woort gereconstitueerd in ‘n concentratie vaan 4000 celequivalente/μl. Analyseer ‘t steekproef door middel vaan omgekeerde fasechromatografie (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en CORTECS T3-kolom (2,1×150 mm, deilkesgrootte 1,6-μm, poriegrootte 120-Å; #186008500, Waters). Polaire massaspectrometer (6470, Agilent), boe-in elektrospray-ionisatie in positieve modus wèrk. Mobiele fase A is 0,1% mierzuur (in H2O), mobiele fase B is 90% acetonitriel, 0,1% mierzuur. De LC-gradiënt is 0 tot 2 minute veur 100% A, 2 tot 7,1 minute veur 99% B en 7,1 tot 8 minute veur 99% B. Vervolgens her-equilibreer de kolom mit mobiele fase A mit un stroumingssnelheid vaan 0,6 ml/min veur 3 minute. . De stromingssnelheid is 0,4ml/min, en de kolomkamer weurt tot 50°C verhits. Gebruik MNA’s pure chemische standaard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) um retentietied (RT) en transformatie (RT = 0,882 minute, transformatie 1 = 137→94,1, transformatie 2 = 137→92 , Conversie = 13→777) vas te stèlle. Es alle drei de euvergaange op de juiste retentietied plaotsvinde, weurt euvergaank 1 gebruuk veur kwantificering um specificiteit te garandere. De standaardcurve vaan MNA (Toronto Research Chemical Company) woort gegenereerd door zes seriële verdunninge vaan de veurraodoplossing (1 mg/ml) um standaarde vaan 0,1, 1,0, 10 en 100 ng/ml en 1,0 en 10 μg/ml respectievelik vloeistof te kriege. De detectiegrens is 1 ng/ml, en de lineaire reactie is tusse 10 ng/ml en 10μg/ml. Edere injectie vaan twie microliter monster en standaard weurt gebruuk veur LC/MS-analyse, en um de ach injecties weurt ‘n gecombineerd kwaliteitscontrolemonster oetgeveurd um de stabiliteit vaan ‘t analyseplatform te garandere. De MNA-reacties vaan alle MNA-behandelde celmonsters waore binne ‘t lineaire bereik vaan de testing. Data-analyse woort gedoon mit behulp vaan MassHunter kwantitatieve analyse-software (v9.0, Agilent).
De twiede generatie αFR-CAR-construct woort oet Song et al. (59). Kort samegevat, ut construct bevat de volgende inhoud: CD8a leidersequentie, minselik αFR-specifiek single-chain variabel fragment, CD8a scharnier en transmembraan regio, CD27 intracellulair domein en CD3z intracellulair domein. De complete CAR-sequentie woort door GenScript gesynthetiseerd en vervolgens gekloond in de twiede-generatie lentivirale expressievector stroomopwaarts vaan de GFP-expressiecasset dee woort gebruuk um de transductie-efficiëntie te evaluere.
Lentivirus weurt geproduceerd door transfectie vaan HEK293T-celle [American Type Culture Collection (ATCC); gegreujd in Dulbecco’s gemodificeerde Eagle-medium mit 10% fetaal bovine serum (FBS) en 1% PenStrep, en gebruukde CAR-GFP-vector en de verpakkingsplasmiden (psPAX2 en pMD2.G, Addgene) gebruukde lipofectie-amine (Sigma-Aldrich). ‘t Virusbevattende supernatant woort 48 en 72 oor nao de transfectie verzameld, gefilterd en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Bewaar ‘t geconcentreerde virale supernatant bij -80°C tot transductie.
PBMC were gesjeije vaan gezonde donorleukocyte-sjeiingsprodukte (STEMCELL Technologies) door Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugatie. Gebruik positieve selèctie CD8 microkralen (Miltenyi) um CD8+ celle vaan PBMC te isolere. Stimuleer T-celle mit TransAct (Miltenyi) en in TexMACS-medium [Miltenyi; aongevöld mit 3% wermte-geïnactief minselik serum, 1% PenStrep en IL-2 (300 U/ml)]. Veer-en-twinteg oor nao stimulatie woorte T-celle getransduceerd mit lentivirus (10 μl geconcentreerd virussupernatant per 106 celle). 1 tot 3 daog nao transductie op Cytek Aurora (op FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evalueer de GFP-expressie vaan de celle um ‘n transductie-efficiëntie vaan op z’n mins 30% te laote zien.
CAR-T-celle woorte 24 oor in Immunocult (STEMCELL Technologies; aongevuld mit 1% PenStrep) gekweek onder de volgende umstandeghede: neet behandeld, behanjeld mit 250 μM adenosine of 10 mM MNA. Nao de veurbehandeling woorte CAR-T-celle gewasse mit PBS en gecombineerd mit 20.000 SK-OV-3-celle [ATCC; in McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) aongevuld mit 10% FBS en 1% PenStrep op 10: De effector-doelwitverhawding vaan 1 woort in drievoud versterkt in aangevuld Immunocult medium. SK-OV-3-celle en SK-OV-3-celle gelyseerd mit digitalis saponine (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) woorte respectievelik gebruuk es negatieve en positieve controles. Nao 24 oor co-cultivatie woort ‘t supernatant verzameld en woort de lactaatdehydrogenase (LDH) gemete volgens de instructies vaan de fabrikant (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). De LDH-supernatant woort 1:50 in de LDH-buffer verdund. ‘t Percentaasj vaan doed woort gemaete mit de volgende formule: percentaasj vaan doed = percentaasj vaan correctie / maximum doedpercentage x 100%, boebij percentaasj vaan correctie = allein co-culture-T-celle, en maximum doedpercentage = positieve controle-negatieve controle.
Zoas besjreve in de teks of in de materiale en methodes, gebruuk GraphPad Prism 8, Microsoft Excel of R v3.6.0 veur statistische analyse. Es meerdere monsters vaan dezelfde patiënt weure verzameld (zoe wie ascites en tumor), gebruuke veer ‘n gepaarde t-test of numme veer de patiënt es ‘n willekeurig effek in ‘n lineair of algemein model, wie gepas. Veur de metabolomische analyse weurt de belangstest in drie exemplare oetgeveurd.
Veur aanvullende materiaal veur dit artikel, zuug http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dit is un open touwgaank artikel verspreid oonder de veurwaardes vaan de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, die ‘t gebruuk, verspreiding en reproductie in eder medium meugelek maak, zolaank ‘t oeteindelek gebruuk neet veur commercieel gewin is en ‘t oetgangspunt is dat ‘t orzjineel werk korrek is. Referens.
Opmerking: Ver vraoge uuch allein um eur e-mailadres op te geve zodet de persoen dee geer aon de pagina aanbeveelt weit dat geer de e-mail wilt zeen en dat ‘t gein spam is. We zulle gein e-mailadresse vastlègke.
Deze vraog weurt gebruuk um te teste of geer un bezeuker zit en um automatische spam-inzending te veurkómme.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephardini (R.R.B.R.B.R.R. B. B. B. R. B. B. R. B. R. B. B. R. B. R. B. R. B. B. R. B. B. B. B. R. B. Ru.). Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draag bij aan de immuunsupressie vaan T-celle en representeert un potentieel immunotherapiedoelwit veur de behandeling vaan minseleke kanker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephardini (R.R.B.R.B.R.R. B. B. B. R. B. B. R. B. R. B. B. R. B. R. B. R. B. B. R. B. B. B. B. R. B. Ru.). Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draag bij aan de immuunsupressie vaan T-celle en representeert un potentieel immunotherapiedoelwit veur de behandeling vaan minseleke kanker.
©2021 Amerikaanse Vereineging veur de Veuroetgaank vaan de Wetensjap. alle rechte veurbehawwe. AAAS is un partner vaan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.