Eiwitsortere in de secretore weeg is essentieel veur ‘t behawwe vaan celcompartimentalisatie en homeostase. In aanvulling op sjelp-gemedieerde sortering, is de rol vaan lipides in kinesine sortering in ‘t proces vaan secretore transport ‘n laankdurende basisvraog dee nog neet is beantwoord. Hei make ver 3D simultane multikleurige hoegresolutie real-time aafbeeldinge oet um in vivo te bewieze dat nuuj gesynthetiseerde glycosylphosphatidylinositol-geimmobiliseerde eiwitte mit hieël lange ceramide lipidedeile geclusterd en geclassificeerd zien in gespecialiseerde endoplasma Net exit site, wat angesj is es dee door transmembraan eiwitte die weure gebruuk. Daoneve laote veer zien dat de kettinglengte vaan ceramide in ‘t endoplasmatische reticulummembraan essentieel is veur dees sorteerselectiviteit. Ozze studie lievert ‘t ierste directe in vivo bewies op um eiwitladinge te classificere op basis vaan de lipidekettinglengte in selèctieve exportlocaties in ‘t secretore weeg.
In eukaryotische celle weure de eiwitte die in ‘t endoplasmatische reticulum (ER) gesynthetiseerd zien, vervolgens gesorteerd tijdens ‘t transport door ‘t secretore weeg veur ‘t levere nao hun gepaste cellulaire bestumming (1). Neve door de vach gemedieerde sortere, woort lang gespeculeerd dat bepaolde lipide ouch kinne dene es selèctieve oetgangspunte door ze te clustere in specifieke membraandomeine es specifieke eiwitte (2-5). D’r is echter nog steeds ‘n gebrek aon direct in vivo bewies um dit meugelek op lipide gebaseerde mechanisme te bewieze. Um dit basisprobleem op te losse, höbbe veer in gis bestudeerd wie glycosylphosphatidylinositol (GPI) geankerde eiwitte (GPI-AP’s) versjillende meneer weure geëxporteerd vaanaof de ER. GPI-AP’s zien ‘n versjeieheid aon lipide-verboonde celloppervlakteiwitte ( 6, 7). GPI-AP is ‘n aofgesjeie eiwit dat via ‘t glycolipide-deil (GPI-anker) aon de boeteste blaajer vaan ‘t plasmamembraan is vasgemaak. Ze acceptere GPI-ankers es conservatieve post-translasjonele modificaties in ‘t ER-lumen (8). Nao bevestiging geit GPI-AP door ‘t Golgi-apparaat (5, 9) vaanaof de ER nao ‘t plasmamembraan. De aanwezigheid vaan GPI-ankers zörg d’r veur dat GPI-AP apaart vaan transmembraansecreteeerde eiwitte (inclusief aandere plasmamembraaneiwitte) langs de secretoreweeg weurt getransporteerd (5, 9, 10). In giscelle weure GPI-AP’s gesjeije vaan aander aofgesjeie eiwitte in ‘t endoplasmatische reticulum, en vervolgens verpakt in unieke vesikels verwikkeld door coat-eiwitcomplex II (COPII) (6, 7). De bepaolende factore vaan dit classificatieproces in ‘t ER-exportproces zien oondudelek, mer d’r weurt gespeculeerd dat dit mechanisme lipide kin vereise, veural de structurele hermodellering vaan ‘t lipidegedeilte vaan de GPI-anker (5, 8). In gis begint de GPI-lipidehermodellering direk naodat de GPI zich hech, en in väöl gevalle zörg ‘t d’r veur dat ceramide zich bindt aon ‘t 26-koolstof langketting verzaodeg vetzoer (C26:0) (11, 12). C26-ceramide is tot noe toe de belangriekste ceramide die door giscelle weurt geproduceerd. ‘t Weurt in de ER gesynthetiseerd en ‘t groetste deil weurt geëxporteerd nao ‘t Golgi-apparaat via COPII-vesikels (13). De ER-export vaan GPI-AP vereis specifiek doorloupende ceramidesynthese (14, 15), en op zien beurt is de umzètting vaan ceramide nao inositolfosfaat ceramide (IPC) in ‘t Golgi-apparaat aafhankelik vaan de GPI-ankersynthese (16). Biofysische studies mit kunsmatige membrane höbbe aongetoend dat hiel lange acylkettingceramide kinne samekomme um geordende domeine mit unieke fysieke eigensjappe te vörme (17, 18). Dees data leide tot de hypothese dat C26-ceramide en GPI-AP mit C26-ceramide hun fysieke eigensjappe gebruke um same te komme in geordende regio’s of regio’s in de relatief rommelig ER-membraanlipide umgeving. ‘t Is veural samegesjtèld oet korte en onverzadigde glycerolipide (C16:1 en C18:1) (19, 20). Dees regio’s zulle selèctief weure geriech op specifieke ER-oetgangsplaotse (ERES), boe ceramide en op ceramide gebaseerde GPI-AP same nao de Golgi kinne weure getransporteerd in dezelfde toegewijde COPII-vesikel (5).
In dit oonderzeuk höbbe veer dit op lipide gebaseerde mechanisme direk getes door super-resolutie confocal real-time imaging microscopy (SCLIM) te gebruke, waat ‘n geavanceerde microscopietechniek is dee tegeliekertied fluorescerend gelabelde eiwitte kin observere.
Ver hebbe iers SCLIM-technologie touwgepas um wiejer te definiëre wie normale GPI-AP mit C26 ceramidegroep woort gescreend vaan transmembraansecreeerde eiwitte nao ‘t verlaote vaan de ER in S. cerevisiae. Um de classificatie vaan ER te controlere, gebruukde veer ‘n genetisch systeem dat nuuj gesynthetiseerde vrach direct kin visualisere die in vivo ERES binnekomt (7, 23). Es lading koze veer C26-ceramide-gebaseerde GPI-AP Gas1 gelabeld mit greun fluorescerend eiwit (GFP) en transmembraansecreteer eiwit Mid2 gelabeld mit naar-infraroed fluorescerend eiwit (iRFP), die allebei op ‘t plasmamembraan zien geriech (24-26). In de sec31-1 temperatuurgeveulege mutant were dees twie ladinge oetgedruk oonder ‘n galactose-induceerbare promotor en ‘n constitutieve ERES-marker. Bij de extreme temperatuur (37°C), umdat de sec31-1-mutatie de functie vaan ‘t COPII-coatcomponent Sec31 beïnvlood um COPII-ontkieming en ER-export te remme, verzamelt zich nuuj gesynthetiseerde lading op de ER (23). Nao ‘t aafkeule tot ‘n liege temperatuur (24°C), herstèlde de sec31-1-mutante celle zich oet ‘t secretoregebied en begos de opgebouwde nuie synthetische vrach oet de ER te weure geëxporteerd. CLIM-visualisatie leet zien dat de meiste vaan de nuuj gesynthetiseerde Gas1-GFP en Mid2-iRFP zich nog steeds in de ER vaan de sec31-1-mutante celle verzamelde nao incubatie bij 37°C en vervolgens bij 24°C veur 5 minute losgelaote woorte (Figuur 1). Umdet Mid2-iRFP verdeild is op ‘t ganse ER-membraan, en Gas1-GFP is geconcentreerd en verzameld in ‘t discontinue ER-membraangebeed, is hun verdeiling gans anders (Figuur 1, A tot C en Film S1). Daoneve, wie in Figuur 1D te zien is, heet de Gas1-GFP-cluster gein Mid2-iRFP. Dees resultate wieze op dat GPI-AP en transmembraan eiwitte vreug in versjillende ER-membraanregio’s woorte gesjeie. De Gas1-GFP-cluster ligk naeve ‘n specifiek ERES gelabeld mit mCherry’s COPII-coat-eiwit Sec13 (Figuur 1, E en F, en film S1) (23).
sec31-1-celle expressere door galactose-geïnduceerde secreties, ‘n lange acylchain (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, greun) en ‘t transmembraan eiwit Mid2-iRFP (TMP, blauw) en dit Constructief ERES-labelling Sec13-mCherry (E) woort geïncubeerd veur RES30°C, 30 minute, verplaots nao 24°C, en 5 minute later door SCLIM aafgebeeld. (A tot C) toent un representatief samegevoogde of inkele 2D-beeld vaan un vlak (A), un 2D-projeksiebeeld vaan 10 z-secties (B) of un 3D-celhelfrondbeeld vaan cargo- en ERES-markers (C). Sjaolbalk 1μm (A en B). De sjaol is 0,551 μm (C). Gas1-GFP woort gedetecteerd in discrete ER-regio’s of clusters, onderwieles dat Mid2-iRFP woort gedetecteerd en verdeild door ‘t ER-membraan (C). (D) De grafiek toent de relatieve fluorescentie-intensiteit vaan Gas1-GFP en Mid2-iRFP in de Gas1-GFP-cluster langs de witte pijllijn (links). AU, willekeurige einheid. (E en F) vertegenwoordige ‘t 3D-beeld dat ‘t goedere en ‘t ERES-merk combineert. Gas1-GFP-clusters woorte gedetecteerd in de buurt vaan de specifieke ERES. De sjaol is 0,551 μm. (F) De witte vaste pijl markeert de Gas1-GFP-cluster die geassocieerd is mit ERES. De midde- en rechterpanele toene de samegevoegde vergroete 3D-beeld en ‘n gedrejde weergaaf vaan de geselecteerde Gas1-GFP-cluster.
De nauwe ruimteleke relatie tösse de Gas1-GFP-cluster en ‘n specifieke ERES gief aon dat Gas1-GFP selèctieve ERES kin binnegoon, wat aanders is es de selèctiviteit die Mid2-iRFP gebruuk um de ER te verlaote. Um dees meugelikheid aon te pakke, höbbe veer de ERES-ratio veur mer ein of twie geujere gekwantificeerd (Figuur 2, A tot C). We höbbe gevoonde dat de mieste ERES (70%) mer ein soort lading bevatte. De oonderste aafbeelding vaan Figuur 2C toent twie typische veurbeelde vaan ERES mèt allein Gas1-GFP (Figuur 1) of allein Mid2-iRFP (Figuur 2). Daoretege bevat ongeveer 20% vaan de ERES twie ladinge die in ‘tzelfde gebeed euverlappe. D’r woort gevoonde dat sommige ERES (10%) twie soorte vrach bevatte, mer dat ze in dudelik versjillende gebeeje waore geïsoleerd. Daorum toent deze statistische analyse dat naodat de ER is geëxporteerd, GPI-AP Gas1-GFP en de transmembraanlading Mid2-iRFP in versjillende ERES weure verdeild (Figuur 2D). Deze sorteer-efficiëntie is erg consistent mit de veurege biochemische analyse (6) en morfologische bepaoling (7). Ver kinne ouch ‘t gedrag vaan de in quarantaine vrach observere die ERES binnekump (Figuur 2E en Film S2). Figuur 2E toent aon dat mer un klein deil vaan Gas1-GFP (paneel 3) of Mid2-iRFP (paneel 4) de ERES vaan eine kant binnekump en in un discreet gebeed is beslote. Paneel 5 vaan Figuur 2E toent aon dat Gas1-GFP en Mid2-iRFP soms in dezelfde ERES weure gevoonde, mer dat ze vaan versjèllende kante binnekomme en zien geconcentreerd in apaarte regio’s die versjèllende COPII-vesikels kinne representere. Ver höbbe ouch bevestige dat de geobserveerde sjeiing en classificatie vaan C26-ceramide-gebaseerde GPI-AP Gas1 es selèctieve ERES specifiek is umtot ‘n aander transmembraansecretielading, ‘t GFP-getagde plasmamembraaneiwit Axl2 (27 ), vergeliekbaar gedrag toent es Mid2-iRFP. (Afbeelding S1 en Film S3). De nuuj gesynthetiseerde Axl2-GFP weurt verdeild door ‘t ER-membraan wie Mid2-iRFP (Figuur S1, A en B), en is co-gelokaliseerd mèt Mid2-iRFP in de mieste ERES (Figuur S1, B tot D). Paneele 1 en 2 vaan Figuur 1. S1C toent twie typische veurbeelde vaan ERES boe twie transmembraanladinge euverlappe. In dees gevalle gaon allebei geujere same ERES binne (Figuur S1E, Paneel 3 en Film S3).
De sec31-1-celle die galactose-induceerbare secreties oetdrukke, Gas1-GFP (GPI-AP, greun) en Mid2-iRFP (TMP, blauw) en constitutief ERES-labeling vaan Sec13-mCherry (ERES, magenta) woorte geplaats op 37 Nao ‘t incubere veur 30 minute bij °C, verplaatste nao ‘t beeld en ‘t ion geblokkeerd mit SCLIM nao 20 minute. (A tot C) Representatieve 2D-projeksiebeelde (A; sjaolbalk, 1μm) of 3D-celhalfrondbeelde (B en C; sjaoleenheid, 0,456μm) vaan de lading en 10 z-secties gemarkeerd door ERES. ‘t Oonderste paneel in (B) en ‘t paneel in (C) toene verwèrkde aafbeeldinge um allein de geujere die in ERES (magenta) [Gas1-GFP (gries) en Mid2-iRFP (lichtblauw)] zien. (C) Open pijl: ERES draag mer ein lading (1 tot 4). Grieze pijl: ERES bevat gescheide vrach (5). Witte vaste pijl: ERES mit samegevoonde vrach. Onder: De geselecteerde enkele ERES bevat allein Gas1-GFP (1) of Mid2-iRFP (2). Sjaolbalk, 100 nm. (D) Kwantificering vaan de fotomicrograaf besjreve in (C). ‘t Gemiddelde percentaasj vaan ERES dat mer ein vrach (Gas1-GFP of Mid2-iRFP) bevat, gescheide vrach en euverlappende vrach. In drie onaafhankelike experimente, n=432 in 54 celle. Foutbalk = SD. Twee-staart ongepaarde t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-beeld vaan geselecteerde ERES vaan in quarantaine vrach gemarkeerd mèt (C). Gas1-GFP (greun) (3) of Mid2-iRFP (blauw) (4) kump ERES (magenta) vaan ein kant binne en is beperk tot ‘n klein gebeed binne ERES. Soms gaon allebei soorte vrach vaan dezelfde kant de ERES binne (5) en zien ze beperk tot ‘n geïsoleerd gebeed binne de ERES. Sjaolbalk, 100 nm.
Daonao teste we ‘n hypothese dat de lange acyl ketting ceramide (C26) aanwezig in ‘t ER-membraan de specifieke clustering en sortering vaan Gas1 in selèctieve ERES aofstuurt. Heiveur gebruukde veer ‘n gemodificeerde gisstam GhLag1, boebij de twie endogene ceramidesynthases Lag1 en Lac1 woorte vervange door GhLag1 (de Lag1-homoloog vaan katoen), wat resulteerde in ‘n gisstam mit ‘n celmembraan Ceramidestam korter es wilde type (Figuur 3A) (28). Massaspectrometrie-analyse (MS) leet zien dat in wilde-typestamme 95% vaan de totale ceramide ‘n hiel lange (C26) ketting ceramide is, terwijl in GhLag1 85% vaan de ceramide ‘n hiel lang is (C18 en C16). ), mer 2% vaan ceramide is ‘n hiel lang (C26) ketting ceramide. Alhoewel C18- en C16-ceramide tot noe toe de belangriekste ceramides zien die in ‘t GhLag1-membraan zien gedetecteerd, bevestigde MS-analyse ouch dat de GPI-anker vaan Gas1-GFP die tot expressie woort gebrach in de GhLag1-stam C26-ceramide bevat, wat vergeliekbaar is mit wildtype lipide. De kwaliteit is ‘tzelfde (afb. 3A) (26). Dit beteikent daorum dat ‘t ceramide-hermodelerende enzym Cwh43 hoeg selèctief is veur C26-ceramide, wie in Figuur 26 weurt aongegeve, ‘t in veurkeur de GPI-anker vaan ‘n klein wieväölheid C26-ceramide in de GhLag1-stam gebruuk. S2 (29). Desalniettemin bevat ‘t celmembraan vaan GhLag1 in feite allein C18-C16 ceramide, onderwieles dat Gas1-GFP nog altied C26 ceramide heet. Dit feit maak vaan deze stam un ideaal instrumint um specifiek ut probleem vaan de acylkettinglengte vaan membraanceramide in de ER op te losse. De hypothetische rol vaan klasse en sortere. Daonao bestudeerde we iers ‘t vermogen vaan C26 Gas1-GFP um zich in clusters in GhLag1 mit ‘n temperatuurgeveulige mutant allel vaan sec31-1 te verzamele door middel vaan conventionele fluorescentiemicroscopie, boe allein de lange (C18-C16) ketting in ‘t ER-membraan Ceramide besteit (Afb. 3). We observeerde dat in sec31-1 ‘t groetste deil vaan Gas1-GFP in clusters waor geconcentreerd, onderwieles dat Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 mit ‘n lang (C18-C16) lang ceramide ER-membraan hoofzakelik neet geclusterd en verdeild waor in ‘t ganse ER-membraan. Um persies te zien, umtot C26-ceramide-gebaseerde clustering nauw verboonde is aon specifieke ERES (Figuur 1), höbbe veer daonao oonderzeuk of dit proces ouch de functie vaan ‘t ER-export-eiwitmechanisme kin bevatte. GPI-AP gebruuk un speciaal COPII-systeem veur ER-export, wat actief weurt gereguleerd door Ted1′s structurele hermodellering vaan ‘t glycangedeilte vaan de GPI-anker (30, 31). De recombinante GPI-glycaan weurt vervolgens herkènd door ‘t transmembraan cargoreceptor p24 complex, wat op zien beurt Lst1 selèctief rekruteert, wat ‘n specifieke isovörm is vaan de belangriekste COPII cargo binding subeinheid Sec24, wat ‘n GPI-AP-rieke COPII vörmp Vesicles zien nuudig (31-33). Daorum höbbe veer ‘n dubbele mutant geconstrueerd dee de deletie vaan dees enkele eiwitte (‘t p24-complex-component Emp24, GPI-glycaan-remodelleringsenzym Ted1 en de specifieke COPII-sub-einheid Lst1) combineerde mèt de sec31-1-mutante stam, en ze bestudeerde Is ‘t meugelik um Gas1-luster GFP te vörme (Figuur 3). We hebbe geobserveerd dat in sec31-1emp24Δ en sec31-1ted1Δ Gas1-GFP veurnamelik neet geclusterd is en verdeild is door ut ER-membraan, wie eerder gezeen in sec31-1 GhLag1, onderwieles in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Like sec31-1-1-1. Dees resultate wieze op dat neve de aanwezigheid vaan C26-ceramide in ‘t ER-membraan, de clustering vaan Gas1-GFP ouch aon ‘t p24-complex moot binde en gein specifieke Lst1-werving nuudig heet. Vervolgens onderzochde veer de meugelekheid dat de kettinglengte vaan ceramide in ‘t ER-membraan de binding vaan Gas1-GFP aon p24 kin regulere. Ver höbbe echter gevoonde dat de aanwezigheid vaan C18-C16-ceramide in ‘t membraan gein invlood heet op de GPI-glycane die door ‘t p24-complex zien gereconstrueerd (Figure S3 en S4, A en B) of op ‘t binden aon GPI-AP en ‘t exportere vaan GPI-AP. in sjoat zin. Recruteer COPII-subtype Lst1 (Figuur S4C). Daorum heet C26-ceramide-aafhankelike clustering gein eiwitinteracties nuudig mit versjillende ER-export-eiwitmechanismes, mer ondersteunt un alternatief sorteermechanisme gedreve door de lipidelengte. Vervolgens analyseerde veer of de ceramide-acylakettinglengte in ‘t ER-membraan belangriek is veur de effectieve classificatie vaan Gas1-GFP es selèctieve ERES. Umtot Gas1 in de GhLag1-stam mit kortketting ceramide de ER verlaot en ‘t plasmamembraan binnekump (Figuur S5), geluive veer dat es de sortering weurt gedreve door de lengte vaan de ceramide-acylaketting, de Gas1 in de GhLag1-stam kin weure umgeleid en gekruus. ERES-geujere mit ‘tzelfde membraan.
(A) ‘t Celmembraan vaan GhLag1 bevat veural kortere C18-C16-ceramide, onderwieles de GPI-anker vaan Gas1-GFP nog altied dezelfde C26 IPC heet es wild-type celle. Bove: acylkettinglengteanalyse vaan ceramide in ‘t celmembraan vaan wild-type (Wt) en GhLag1p-stamme door massaspectrometrie (MS). De data vertegenwoordige ‘t percentaasj vaan ‘t totale ceramide. ‘t gemiddelde vaan drei oonaofhenkeleke experiminte. Foutbalk = SD. Twee-staart ongepaarde t-test. **** P ＜0,0001. Oonderste paneel: MS-analyse vaan de acylkettinglengte vaan de IPC aanwezig in de Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-anker, oetgedruk in de wild-type en GhLag1p-stamme. De data vertegenwoordige ‘t percentaasj vaan ‘t totale IPC-signaal. Gemiddeld vaan vief oonaofhenkeleke experiminte. Foutbalk = SD. Twee-staart ongepaarde t-test. ns, neet belangriek. P = 0,9134. (B) Fluorescentiemicrofoto’s vaan sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ en sec31-1lst1Δ celle die galactose-geïnduceerde Gas1-GFP expressere woorte bij 37°C gedurende 30 minute geïncubeerd en woorte ‘n routine vaan fluorescentie oetgeveurd microscopie nao 24°C. Witte pijl: ER Gas1-GFP cluster. Open pijl: Ongegroepeerde Gas1-GFP is verdeild op ‘t ganse ER-membraan, wat de ER-kenmerkende nucleaire ringkleuring toent. Sjaolbalk, 5μm. (C) Kwantificering vaan de fotomicrograaf besjreve in (B). ‘t Gemiddelde percentaasj celle mit ‘n gepunteerde Gas1-GFP-structuur. In drie onafhankelike experimente, n≥300 celle. Foutbalk = SD. Twee-staart ongepaarde t-test. **** P ＜0,0001.
Um dit probleem direk op te losse, höbbe we SCLIM-visualisatie vaan Gas1-GFP en Mid2-iRFP in GhLag1 oetgeveurd mit ‘t sec31-1 temperatuurgeveulige mutante allel (Figuur 4 en Film S4). Naodat de ER bij 37°C woort behawwe en vervolgens bij 24°C woort losgelaote, woort ‘t groetste deil vaan de nuuj gesynthetiseerde Gas1-GFP neet geclusterd en verdeild door ‘t ER-membraan, wie gezeen door conventionele microscope (Figuur 4, A en B). Daoneve umvat ‘n groet percentaasj vaan ERES (67%) twie soorte vrach die dao-in same zien gelege (Figuur 4D). Paneele 1 en 2 vaan Figuur 4C toene twie typische veurbeelde vaan ERES mèt euverlappende Gas1-GFP en Mid2-GFP. Daoneve woorte allebei producte in dezelfde ERES gewerf (Figuur 4E, paneel 3 en film S4). Daorum duide os resultate aan dat de lengte vaan de ceramide-acylketting in ‘t ER-membraan ‘n belangrieke bepaolende factor is veur de aggregatie en classificatie vaan ‘t ER-eiwit.
Sec31-1 GhLag1-celle die galactose-geïnduceerde secreties oetdrukke, Gas1-GFP (GPI-AP, greun) en Mid2-iRFP (TMP, blauw) en constitutief ERES-gelabelde Sec13-mCherry (ERES, magenta) Incubeer bij 37°C. Gaon 30 minute door, valle nao 24°C um aafsjeiing los te laote, en beeld nao 20 minute mit SCLIM. (A tot C) Representatieve 2D-projeksiebeelde (A; sjaolbalk, 1μm) of 3D-celhalfrondbeelde (B en C; sjaoleenheid, 0,45μm) vaan de 10 z-secties gemarkeerd door cargo en ERES. ‘t Oonderste paneel in (B) en ‘t paneel in (C) toene verwèrkde aafbeeldinge um allein de geujere die in ERES (magenta) [Gas1-GFP (gries) en Mid2-iRFP (lichtblauw)] zien. (C) Witte gevulde pijl: ERES, goedere euverlappe. Open pijl: ERES bevat mer ein item. Oonderste paneel: De geselecteerde ERES heet euverlappende produkte (1 en 2) gemarkeerd in (C). Sjaolbalk, 100 nm. (D) Kwantificering vaan de fotomicrograaf besjreve in (C). In de sec31-1 en sec31-1 GhLag1-eenhede is mer ein lading (Gas1-GFP of Mid2-iRFP) opgenome, en ‘t gemiddelde percentaasj vaan ERES veur geïsoleerde lading en euverlappende lading. In drie onafhankelike experimente, n = 432 in 54 celle (sec31-1) en n = 430 in 47 celle (sec31-1 GhLag1). Foutbalk = SD. Twee-staart ongepaarde t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) en ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-beeld vaan geselecteerde ERES mèt euverlappende vrach (3) aongegeve in (C). Gas1-GFP (greun) en Mid2-iRFP (blauw) benadere ERES (magenta) vaan dezelfde kant en blieve in ‘tzelfde ERES-beperkte gebeed. Sjaolbalk, 100 nm.
Dit oonderzeuk lievert direk in vivo bewies op dat op lipide gebaseerde eiwitladinge zien geclassificeerd in selèctieve exportlocaties in de secretore weeg, en onthult ‘t belang vaan de acylkettinglengte veur de classificatieselectiviteit. Mit behulp vaan un krachtige en geavanceerde microscopietechniek geneump SCLIM, höbbe veer de nuuj gesynthetiseerde Gas1-GFP (un groet plasmamembraan GPI-AP mit un hiel lang acylketting (C26) ceramidelipidegedeilte) in gis getoend. (Afbeelding 1). Daonaeve gaon dees twie soorte geujere selèctief versjillende ERES binne (Figuur 2). De acylkettinglengte vaan ‘t cellulaire ceramide in ‘t membraan weurt verminderd vaan C26 tot C18-C16, de Gas1-GFP-cluster weurt verstoord in ‘t discrete ER-gebeed en Gas1-GFP weurt umgeleid um de ER te verlaote mèt ‘t transmembraan-eiwit via ‘tzelfde ERES (Figuur 3 en Figuur 3). 4).
Alhoewel GPI-AP un gespecialiseerd eiwitmechanisme gebruuk um ER te verlaote, höbbe veer gevoonde dat C26-ceramide-afhankelike sjeiing neet aafhankelik is vaan differensjele eiwitinteracties die kinne leie tot ERES-specialisatie (Figure S4 en S5). In plaats daovan ondersteune ós bevindinge un alternatief classificatiemechanisme gedreve door op lipide gebaseerde eiwitclustering en dao-op volgende oetsleting vaan anger lading. Ozze observaties wieze op dat ‘t Gas1-GFP-gebeed of cluster geassocieerd mit ‘n specifiek ERES ‘t transmembraan-aofgesjeie eiwit Mid2-iRFP mis, wat aonguuf dat de C26-ceramide-aofhenkeleke GPI-AP-cluster hun touwtrejje in de relevante ERES zal vergemekeleke, en tegeliekertied transmembraan zal oetslete. Daoretege veroorzaak de aanwezigheid vaan C18-C16-ceramide in ‘t ER-membraan neet dat GPI-AP regio’s of clusters vörmp, zoetot ze neet oetslete of vervange transmembraansecreeerde eiwitte in dezelfde ERES (Figure 3 en 4). . Daorum stèlle veer veur dat C26-ceramide sjeiing en classificatie stimuleert door de clustering vaan eiwitte die verboonde zien aon specifieke ERES te vergemekeleke.
Wie kinste deze C26-ceramide-aafhankelike clustering in un specifiek ER-gebeed bereike? De neiging vaan membraanceramide um ziewaarts te sjeie kin veroorzake dat GPI-AP en C26 ceramide kleine en direk geordende lipide vörme in de mie onregelmaotige lipide umgeving vaan ‘t ER-membraan dee kortere en oonverzadigde glycerolipide bevat. Kwaliteitsclusters (17, 18). Dees kleine tijdeleke clusters kinne wijer weure samegesmolte in groetere, stabieler clusters nao ‘t binden aon ‘t p24-complex (34). In euvereinstumming heijmèt höbbe veer aongetoond dat C26 Gas1-GFP interactie mot höbbe mit ‘t p24-complex um groetere zichtbare clusters te vörme (Figuur 3). ‘t P24-complex is ‘n heterozygote oligomeer samegesjtèld oet veer versjillende p24-transmembraan-eiwitte in gis (35), wat multivalente binding zörg, wat kin leie tot kruusverbinding vaan klein GPI-AP-clusters, boedoor ‘n groetere stabiele cluster weurt gegenereerd (34). De interactie tusse de eiwit-ectodomeine vaan GPI-AP’s kin ouch bijdrage aon hun aggregatie, wie aongetoond tijdens hun Golgi-transport in gepolariseerde epitheelcelle vaan zoogdiere (36). Es C18-C16-ceramide echter aanwezig is in ‘t ER-membraan, es ‘t p24-complex zich bindt aon Gas1-GFP, zulle gein groete apaarte clusters weure gevörmp. ‘t Oonderligkende mechanisme kin aafhenkelek zien vaan de specifieke fysieke en chemische eigesjappe vaan de lange acylketting ceramide. Biofysische studies vaan kunstmatige membrane toene aon dat, hoewel zoewel lange (C24) es korte (C18-C16) acylkettingceramide fasesjeijing kinne veroorzake, allein lange acylkettingceramide (C24) hoege kromming en filmbuiging kinne bevordere um de film te hervörme. Door wederzijdse referentie (17, 37, 38). ‘t Is aongetoend dat de transmembraan helix vaan TMED2, de minseleke homoloog vaan Emp24, selèctief interageert mèt C18-ceramide-gebaseerde sphingomyeline in de cytoplasmatische lobules (39). Door moleculaire dynamiek (MD) simulaties te gebruke, höbbe veer gevoonde dat zoewel C18 es C26 ceramides zich verzamele roond de cytoplasmatische lobules vaan de Emp24 transmembraanhelix, en dat ze vergeliekbaar veurkeure höbbe (Figuur S6). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat dit aonguuf dat de transmembraan helix vaan Emp24 kin leie tot ‘n asymmetrische verdeiling vaan lipide in ‘t membraan. Dit is un recent resultaat gebaseerd op celle vaan zoogdiere. Vergeliekbare MD-simulaties toene ouch de aanwezigheid vaan etherlipide (40) . Daorum speculere we dat C26-ceramide in de twie lobules vaan ER26 lokaal verriek is. Es GPI-AP in de luminale lobules zich direk bindt aon multivalente p24 en de accumulatie vaan C26 ceramide roond p24 in de cytoplasmatische lobules, kin dit de bijbehurende Proteïne-aggregatie en membraankromming bevordere die door de vingers weure gegenereerd (41), boedoor GPI-AP zich sjeidt in discrete regio’s naeve ERES, die ouch de veurkäör geve aon de hoege geboge regio’s vaan RES ‘t ER-membraan (42). Veurige rapporte ondersteunde ‘t veurgestèlde mechanisme (43, 44). De multivalente binding vaan oligolectine, pathogene of antiliechame aon op ceramide gebaseerde glycosfingolipide (GSL) op ‘t plasmamembraan veroorzaak groete GSL-aggregatie, verbetert fasesjeijing en veroorzaak membraanvervörming en internalisatie (44). Iwabuchi etc. (43) D’r woort gevoonde dat in de aanwezigheid vaan lange (C24) mer neet korte (C16) acylkettinge, ‘t multivalente ligand geboonde aon GSL-lactosylceramide de vörming vaan groete clusters en membraaninvaginatie induceerde, en de door cytoplasma Lyn-gemedieerde signaaltransductie op de blaajer woort door ‘n neutrofielkette in koppels begeleid.
In gepolariseerde epitheelcelle vaan zoogdiere, controleert de concentratie vaan ‘t anti-Golgi-netwerk (TGN) op ‘t niveau vaan ‘t apicaal plasmamembraan de sjeiing en sortering vaan GPI-AP (10, 45). Dees aggregatie weurt gedreve door GPI-AP oligomerisatie (36), mer ‘t kin ouch aafhange vaan de ceramidekettinglengte die we in gis vinde. Alhoewel de GPI-AP vaan de zoogdiere ‘n op ether lipide gebaseerde anker heet, en zien chemische structuur hiel aanders is es de hiel lange acyl ketting ceramide, bleek oet ‘n recente studie dat beide lipide evolutionair gelieksoortige fysieke en chemische eigesjappe en functies höbbe (40). Daorum kin ‘t etherlipidedeil in zoogdiercelle vergeliekbaar zien mit ‘t C26-ceramide in gis, en zien rol is um te associëre mit de langkettingceramide in ‘t membraan um GPI-AP-aggregatie en sortering te bevordere. Alhoewel dees meugelikheid nog direk moot weure getes, ondersteune iedere bevindinge dat ‘t transport vaan de lange acyl ketting ceramide nao ‘t Golgi-liechaam neet weurt oetgeveurd door cytoplasmatische euverdrachseiwitte, mer aafhankelik is vaan de synthese vaan GPI-ankers wie gis. Daorum liek ‘t evolutionaire conservatieve mechanisme in staot te zien um selèctief ‘n hieël lang acyl ketting ceramide en GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in dezelfde transportvesikel same te transportere.
In gepolariseerde epitheelcelsysteme vaan gis en zoogdiere, vint GPI-AP-aggregatie en sjeiing vaan aander plasmamembraan-eiwitte allemaol plaots veurtot ‘t ‘t celoppervlak bereik. Paladino et al. (48) voont dat op de TGN vaan gepolariseerde epitheelcelle vaan zoogdiere, GPI-AP-clustering neet allein nuudig is veur de selèctieve classificatie vaan GPI-AP’s in ‘t apicaal plasmamembraan, mer ouch de clusteringsorganisatie vaan GPI-AP’s en de biologische activiteit devaan reguleert. Celoppervlak. In gis leet dit oonderzeuk zien dat de C26-ceramide-aofhenkeleke GPI-AP-cluster op de ER de clusterorganisatie en functionele activiteit vaan GPI-AP op ‘t plasmamembraan kin regulere (24, 49). In lijn mit dit model zien GhLag1-celle allergisch veur GPI-remmers of medicijne die de integriteit vaan de celwand beïnvleuje (28), en de behoefte aon functionele Gas1-GFP-clusters (49) vaan de puntceramide die in ‘t paring vaan giscelle weurt geprojekteerd, gief G Meugeleke fysiologische gevolge vaan hLag1-celle aon. GPI-AP fout. Wiejere teste of de functionele organisatie vaan ‘t celoppervlak is geprogrammeerd vaanaof de ER door ‘n sorteermethode gebaseerd op de lipidelengte zal ‘t oonderwerp zien vaan euze toekomstig oonderzeuk.
De Saccharomyces cerevisiae-stamme die in dit werk zien gebruuk, zien in Tabel S1 vermeld. De MMY1583 en MMY1635 stamme vaan SCLIM veur levende celbeeldvorming woorte geconstrueerd op de achtergroond vaan W303. Dees stamme die Sec13-mCherry expressere mit un fluorescerend eiwittag woorte geconstrueerd met behölp vaan un op polymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde methode mit pFA6a-plasmide es sjabloon (23). De stam die Mid2-iRFP expresseert, gelabeld mit fluorescerend eiwit oonder de controle vaan de GAL1-promotor woort als volg geconstrueerd. PCR-amplificatie vaan iRFP-KanMx-sequentie vaan pKTiRFP-KAN-vector (geschenk vaan E. O'Shea, Addgene-plasmidenummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; oonderzeuksbronne-identificatie (RRID): Addgene_64687) En in de endogene C-termind vaan 22. Naodat de Mid2-iRFP-genoomsequentie waor versterkt en gekloond in de GAL1-promotor, woort ‘t geïntegreerd in de Not I-Sac I-site vaan ‘t integratieplasmide pRS306. ‘t Resulterende plasmide pRGS7 woort gelineariseerd mit Pst I um te integrere in de URA3-locus.
‘t Gas1-GFP-fusiegen weurt oetgedruk oonder de controle vaan de GAL1-promotor in ‘t centromeer (CEN) plasmide, wat es volg is geconstrueerd. De Gas1-GFP-sequentie woort door PCR geamplificeerd vaan ‘t pRS416-GAS1-GFP-plasmide (24) (cadeau vaan L. Popolo) en gekloond in de Xma I–Xho I-site vaan ‘t CEN-plasmide pBEVY-GL LEU2 (cadeau vaan C) . Miller; Addgeen plasmidenummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). ‘t Resulterende plasmide woort pRGS6 geneump. ‘t Axl2-GFP-fusiegen weurt ouch oetgedruk oonder de controle vaan de GAL1-promotor vaan de pBEVY-GL LEU2-vector, en de constructie devaan is wie volg. De Axl2-GFP-sequentie woort geamplificeerd vaanoet pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmide (23) door PCR en gekloond in de Bam HI-Pst I-site vaan pBEVY-GL LEU2-vector. ‘t Resulterende plasmide woort pRGS12 geneump. De volgorde vaan de oligonucleotide die in dit oonderzeuk zien gebruuk, is in Tabel S2 vermeld.
De stam woort aongevuld mit 0,2% adenine en 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] riek gistextract eiwit p (YP) medium (1 % gisextract en 2% eiwit ept). (YPR)] of 2% galactose [YP-galactose (YPG)] es koolstofbron, of in un synthetisch minimaal medium (0,15% giststikstofbasis en 0,5% ammoniumsulfaat) um de gepaste aminozure en bases die nuudig zien veur voeding aon te völle, en bevattende 2% glucose (2% glucose) of minimale glucose galactose (synthetisch galactose minimaal medium) es koolstofbron.
Veur real-time beeldvorming woorte temperatuurgeveulege sec31-1-mutante celle die ‘t construct onder de GAL1-promotor expresseerde in YPR-medium bij 24°C euvernach tot mid-logfase gegreujd. Nao inductie in YPG bij 24°C veur 1 oor, woorte de celle gedurende 30 minute in SG bij 37°C geïncubeerd en daonao euvergedrage nao 24°C um los te laote vaan ‘t secretieblok. Concanavalin A woort gebruuk um de celle op un glaasplaat te bevestige en door SCLIM aafgebeeld. SCLIM is ‘n combinatie vaan Olympus IX-71 umgekierde fluorescentiemicroscoop en UPlanSApo 100×1.4 numerieke apertuur olielens (Olympus), snelle en hoege signaal-tot-ruusverhaoding roterende schijfconfocaal scanner (Yokogawa Electric), aangepaste spectrometers, intensiefbeeldingssysteme (Hamamatsu Photonics) kin un vergrootglassysteem mit un definitieve vergroeting vaan ×266,7 en un lading-gekoppelde apparaatcamera die elektrone vermeinigvöldig (Hamamatsu Photonics) (21) levere. Beeldopname weurt oetgeveurd door aangepaste software (Yokogawa Electric). Veur 3D-beelde gebruukde veer ‘n op maat gemaakde piëzo-elektries aondrieving um de objectief verticaal te vibrere en verzamelde veer de optische deile op 100 nm oetein in ‘n stapel. De Z-stack-beeld weurt umgezat in 3D-voxeldata, en de theoretische puntverspreidingfunctie die weurt gebruuk veur de dreijende schijfconfocale microscoop weurt gebruuk veur deconvolutieverwèrking door Volocity-software (PerkinElmer). Door Volocity-software te gebruke um automatisch ‘n drempel te bepaole veur co-locatie-analyse, woort ERES, inclusief vrach, gemaete. Linescananalyse woort oetgeveurd mit behulp vaan MetaMorph software (Molecular Devices).
Gebruik GraphPad Prism-software um de statistische beteikenis te bepaole. Veur de twie-sjtartige Student’s t-test en de gewoene eenweg-analyse vaan variantie (ANOVA)-test weure versjille tösse gróppe besjouwd es ‘n significante invlood op P <0,05 (*).
Veur de fluorescentiemicroscopie vaan Gas1-GFP woorte de logfasecelle euvernach in YPD gegreujd en verzameld door centrifugatie, twie kier gewasse mit fosfaatgebufferde zoutvloeistof, en geïncubeerd op ies veur minstes 15 minute, en vervolgens oonder de microscoop doorgegaon wie eerder besjreve Controleer (24). De Leica DMi8-microscoop (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) oetgerös mit un objectief, L5 (GFP) filter, Hamamatsu-camera en Application Suite X (LAS X) software woort gebruuk veur de opname. .
De monsters woorte gedurende 10 minute gedenatureerd mit SDS-monsterbuffer bij 65°C en vervolgens gesjeije door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Veur immunoblotting-analyse woort 10 μl monster per baan gelaoje. Primair antiliechaam: Gebruuk knien polyklonaal anti-Gas1 mit un verdunning vaan 1:3000, knien polyklonaal anti-Emp24 mit un verdunning vaan 1:500 en knien polyklonaal anti-GFP (‘n kado vaan H. Riezman) in un verdunning vaan 1:3000. ‘t Monoklonale anti-Pgk1-antiliechaam vaan de moes woort gebruuk bij ‘n verdunning vaan 1:5000 (‘n kado vaan J. de la Cruz). Secundair antiliechaam: mierwortelperoxidase (HRP) geconjugeerde geite anti-knijn immunoglobuline G (IgG) gebruuk bij ‘n verdunning vaan 1:3000 (Pierce). HRP-geconjugeerde geite-anti-muis IgG woort gebruuk bij ‘n verdunning vaan 1:3000 (Pierce). De immuunresponszone woort woergenome door de chemiluminescentiemethode vaan SuperSignal West Pico-reagent (Thermo Fisher Scientific).
Zoals besjreve in (31), woort un natuurlik immunoprecipitatie-experiment oetgeveurd op de verriekde ER-fractie. Kort samegevat, was giscelle mit TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride en protease-remmermengsel) op 600 nm (OD600) op 100 optische dichtheid twie kier. ‘t Woort gebroke mit glaze kraole, en daonao woorte ‘t celpuin en de glaze kraole door centrifugatie weggehaold. ‘t Supernatant woort vervolgens gecentrifugeerd op 17.000 g veur 15 minute op 4°C. De pellet woort hersuspendeerd in TNE en digitalis saponine woort touwgevoog tot ‘n eindconcentratie vaan 1%. De suspensie woort 1 oor geïncubeerd mit rotatie bij 4°C, en daonao woorte de oonoplosbare komponente gedurende 60 minute door centrifugatie bij 13.000 g bij 4°C weggehaold. Veur Gas1-GFP-immunoprecipitatie, pre-incubeert ut monster iers mit lege agarosekralen (ChromoTek) bij 4°C veur 1 oor, en incubeer daan met GFP-Trap_A (ChromoTek) bij 4°C veur 3 oor. De immunoprecipiteerde krale woorte vief kier gewasse mit TNE mit 0,2% digoxigenine, geëlueerd mit SDS-monsterbuffer, gesjeie op SDS-PAGE en geanalyseerd door immunoblotting.
Zoals besjreve in (31), woort kruusverbindingsbepaoling oetgeveurd op de verriekde ER-fractie. Kortom, de verriekte ER-fractie woort geïncubeerd mit 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionaat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, VS; 20°C, 20 min). De verknoopingsreaksie woort gebleve door glycine toe te voge (50 mM eindconcentratie, 5 minute, 20°C).
Zoals eerder besjreve (50), woort MS-analyse vaan ceramide in wild-type en GhLag1-stamme oetgeveurd. Kort samegevat, de celle woorte gegreujd tot exponentiële fase (3 tot 4 OD600 einhede/ml) in YPD bij 30°C, en 25×107 celle woorte geoogs. Hun stofwisseling weurt geblus mit trichloorazinzuur. Gebruik extractieoplosmiddel [ethanol, water, ether, pyridine en 4,2 N ammoniumhydroxide (15:15:5:1:0,018 v/v)] en 1,2 nmol vaan interne standaard C17 ceramide (860517, Avanti polaire lipide) kwaliteit). Gebruik monomethylaminereagens [methanol, water, n-butanol en methylamine-oplossing (4:3:1:5 v/v)] um ‘n milde alkalische hydrolyse vaan ‘t extract oet te veure, en gebruuk daonao mit water verzaodegde n-butanol um te ontzoete. Oeteindelik woort ‘t extract hersuspendeerd in ‘n positieve oplosser [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetaat] en in de massaspectrometer geïnjecteerd. Multi-reaction monitoring (MRM) woort oetgeveurd veur de identificatie en kwantificering vaan sfingolipide molecule. De TSQ Vantage tertiaire quadrupole massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) is oetgerös mit un robotic nanoflow-ionbron Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) veur lipideanalyse. De botsingsenergie is geoptimaliseerd veur eder ceramidecategorie. MS-gegevens woorte in positieve modus verkrege. Veur eder biologisch replica is ‘t lipidesignaal de mediaan vaan drei oonaofhenkeleke metinge.
Zoals besjreve in (31), woorte de celle (800×107) die Gas1-GFP expresseerde oonderworpe aan natuurlike immunoprecipitatie. De gezuuverde Gas1-GFP woort gesjeije door SDS-PAGE en euvergedrage nao un polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. ‘t Eiwit woort gevisualiseerd door PVDF te kleure mit amidezwart. De Gas1-GFP-band woort oet de PVDF gesnooje en 5 kier mit methanol en eine kier mit water vaan vloeibaarchromatografie-MS (LC-MS) kwaliteit gewasse. Door de membraansjtrook te incubere mit 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer en 500μl verse opgeloste 1 M natriumnitrietmengsel bij 37°C veur 3 oor, weurt de lipidefractie losgelaote vaan Gas1-GFP en gelyseerd. (51). Daonao woort de membraansjtrook veer kier gewasse mit LC-MS-kwaliteitswater, gedroog bij kamertemperatuur en bewaord in un stikstofatmosfeer bij -80°C tot analyse. Es controle woort veur eder experimint un lege monster vaan PVDF-membraan gebruuk. De lipide geëxtraheerd oet Gas1-GFP woort vervolgens geanalyseerd door MS zoewie besjreve (50). Kort samegevat, PVDF-strips mit GPI-lipide woorte hersuspendeerd in 75μl negatief sjummeloplosmiddel [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium-acetaat] en woorte gepasseerd door electrospray-ionisatie (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipide species (TSQ Vantage). In dit geval woorte MS-gegeves in negatieve ionmodus verkrege.
Zoals ieder al vermeld, woort ‘t lipidegedeilte vaan de GPI-anker gesjeie vaan de [3H]-inositol-gelabelde GPI-AP (16). De lipide woorte gesjeije door dunlaogchromatografie mit behulp vaan un oplosmiddelsysteem (55:45:10 chloroform-methanol-0,25% KCl) en gevisualiseerd mit behulp vaan FLA-7000 (Fujifilm).
De celle die Gas1-GFP (600×107) expresseerde woorte twie kier gewasse mit TNE-buffer mit TNE-buffer, en gebroke mit glaaskraole, en vervolgens gecentrifugeerd um celpuin en glaaskraole te verwijdere. ‘t Supernatant woort vervolgens gecentrifugeerd op 17.000 g veur 1 oer op 4°C. De pellet woort gewasse in TNE en geïncubeerd mit 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE mit 0,2% digitalis saponine veur 1 oor bij 37°C. Nao de enzymbehandeling woort ‘t membraan verwijderd door centrifugatie op 17.000 g op 4°C gedurende 1 oor. Um Gas1-GFP te immunoprecipitere, woort ‘t supernatant euvernach geïncubeerd mit GFP-Trap_A (ChromoTek) bij 4°C. De gezuuverde Gas1-GFP gesjeie door SDS-PAGE woort gekleurd mit Coomassie briljant blauw. De Gas1-GFP-kleuringsband woort aafgesjaord vaan de gries um ‘t aquaduct heen, en daonao nao alkylatie mèt iodoacetamide en reductie mèt dithiothreitol woort in-gel spijsvertering mèt trypsine oetgeveurd. Extraeer en druug tryptische peptide en peptide mit GPI-glycane. ‘t Gedroogde peptide woort opgelos in 20 μl water. Injecteer un portie (8μl) in de LC. ‘N octadecylsilane (ODS) kolom (Develosil 300ODS-HG-5; binnediameter 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) woort gebruuk um peptides te sjeije oonder specifieke gradiëntcondities. De mobiele fase is oplosser A (0,08% mierzuur) en oplosmiddel B (0,15% mierzuur in 80% acetonitriel). Un Accela HPLC-systeem (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) woort gebruuk um de kolom binne 55 minute mit oplosmiddel A te eluere mit un stroumingssnelheid vaan 50 μl min-1 veur 5 minute, en daonao woort de concentratie vaan oplosmiddel B verhoeg tot 40%. , Vereinegde Staote). ‘t Eluaat woort continu geïntroduceerd in de ESI-ionbron, en de tryptische peptides en peptides mit GPI-glycane woorte geanalyseerd door LTQ Orbitrap XL (hybride lineaire ion trap-orbitrap massaspectrometer; Thermo Fisher Scientific). In de MS-opstelling woort de spanning vaan de capillaire bron ingesteld op 4,5 kV, en de temperatuur vaan de euverdrachskapillaire woort op 300°C gehawwe. De kapillaire spanning en de spanning vaan de buislens woorte ingesjtèld op 15 V en 50 V, respectievelik. MS-gegevens woorte verkrege in de positieve ionmodus (resolutie vaan 60.000; massanauwkeurigheid vaan 10 deile per miljoen) in ‘n massabereik vaan 300/m/z massa/ladingverhaoding (m/z) 3000. De MS/MS-gegevens woorte verkrege via de ionval in de LTQ-orbit [XL, die de ciefers iers aafhankelek zien vaan de data botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID)].
MD-simulaties woorte oetgeveurd mit behulp vaan GROMACS (52) software en MARTINI 2 krachveld (53-55). De CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) woort daonao gebruuk um ‘n dubbele laog te make mit dioleoylfosfatidylcholine (DOPC) en Cer C18 of DOPC en Cer C26. De topologie en coördinate vaan Cer C26 zien aafgeleid vaan DXCE door de extra krale vaan de sfingosine-staart te verwijdere. Gebruik ‘t hieronder besjreve proces um de dubbele laog in balans te bringe en ‘t oet te veure, gebruuk daan de lètste coördinate vaan ‘t systeem um ‘n systeem mèt Emp24 te bouwe. ‘t Transmembraandomein vaan gis Emp24 (residue 173 tot 193) woort geconstrueerd es ‘n α-helix met behulp vaan de moleculaire structuur vaan ‘t visueel MD (VMD) hulpmiddel (58). Daonao, nao ‘t verwijdere vaan de euverlappende lipide, woort ‘t eiwit grof granuleerd en in de dubbele laog geplaots met behölp vaan CHARMM GUI. ‘t Eindsysteem bevat 1202 DOPC en 302 Cer C26 of 1197 DOPC en 295 Cer C18 en Emp24. Ioniseer ‘t systeem tot ‘n concentratie vaan 0,150M. Veer onaafhankelike replica’s woorte gemaak veur twie dubbele laogcomposities.
De lipide dubbele laog weurt gebalanceerd mit behulp vaan ‘t CHARMM GUI-proces, wat 405.000 stappe minimalisere en vervolgens in balans bringe, boebij de positiebeperkinge geleidelek weure verminderd en geëlimineerd, en de tiedstap weurt verhoeg vaan 0,005 ps tot 0,02 ps. Nao evenwicht produceert ‘t 6 μs mit ‘n tiedstap vaan 0,02 ps. Nao ‘t invoge vaan Emp24, gebruuk ‘tzelfde CHARMM GUI-proces um ‘t systeem te minimalisere en in balans te bringe, en draai daonao 8 s in de produksie.
Veur alle systeme weurt de druk tijdens ‘t balansingsproces gecontroleerd door de Berendsen-barostaat (59) en tijdens ‘t productieproces weurt de drök gecontroleerd door de Parrinello-Rahman-barostaat (60). In alle gevalle is de gemiddelde drök 1 bar en weurt ‘n semi-isotropisch drökkoppelingssjema gebruuk. In ‘t balans- en productieproces weurt ‘n thermostaat (61) mit snelheidsherkalibrering gebruuk um de temperatuur vaan respectievelik eiwit-, lipide- en oplosmiddeldeilkes te koppele. Tijdens de ganse operatie is de doeltemperatuur 310K. De neet-bindende interactie weurt beraekend door ‘n koppellies te generere met behulp vaan ‘t Verlet-sjema mit ‘n buffertolerantie vaan 0,005. De Coulomb-term weurt beraekend met behölp vaan ‘t reactieveld en ‘n aafsjneeafsjtand vaan 1,1 nm. De Vander Waals-term gebruuk un afsnijsjema mit un aafsjneeafsjtand vaan 1,1 nm, en ut Verlet-afsnijsjema weurt gebruuk veur potentiële drift (62).
Mit behulp vaan VMD is de grensgolflengte tusse DOPC-fosfaatkraole of ceramide-AM1-kraole en ut eiwit 0,7 nm, en ut aontal lipide die met ut eiwit interagere weurt beraekend. Bereken volgens de volgende formule de depletie-verriekkingsfactor (DE) wie in (63): DE-factor = (de wieväölheid totale lipide in ‘t eiwit 0,7) in ‘t eiwit 0,7 (de wieväölheid Cer in totale lipide)
De gerapporteerde waarde weurt verkrege es gemiddelde, en de foutbalke zien veer onaafhankelike kopieje vaan SE. De statistische beteikenis vaan de DE-factor weurt beraekend door t-test [(averageDE-factor-1)/SE]. Bereken de P-waarde op basis vaan de einstaartverdeiling.
‘t GROMACS-hulpmiddel woort gebruuk um de 2D laterale dichtheidskaart vaan ‘t systeem mit Emp24 binne de lètste 250 ns vaan ‘t spoor te berekene. Um de verriekings-/oetputtingskaart vaan ceramide te kriege, weurt de dichtheidskaart vaan Cer gedeild door de som vaan de kaart vaan Cer en DOPC, en vervolgens gedeild door de concentratie vaan Cer in ‘t lief. Dezelfde kleurkaartsjaol weert gebruuk.
Veur aanvullende materiaal veur dit artikel, zuug http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dit is un open touwgaank artikel verspreid oonder de veurwaardes vaan de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, die ‘t gebruuk, verspreiding en reproductie in eder medium meugelek maak, zolaank ‘t oeteindelek gebruuk neet veur commercieel gewin is en ‘t oetgangspunt is dat ‘t orzjineel werk korrek is. Referens.
Opmerking: Ver vraoge uuch allein um eur e-mailadres op te geve zodet de persoen dee geer aon de pagina aanbeveelt weit dat geer de e-mail wilt zeen en dat ‘t gein spam is. We zulle gein e-mailadresse vastlègke.
Deze vraog weurt gebruuk um te teste of geer un bezeuker zit en um automatische spam-inzending te veurkómme.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serhopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hoegresolutie real-time aafbeeldinge onthult ‘t belang vaan de ceramide kettinglengte veur eiwitsortere in selèctieve oetvoerlocaties.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serhopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hoegresolutie real-time aafbeeldinge onthult ‘t belang vaan de ceramide kettinglengte veur eiwitsortere in selèctieve oetvoerlocaties.
©2020 Amerikaanse Vereineging veur de Veuroetgaank vaan de Weitesjap. alle rechte veurbehawwe. AAAS is un partner vaan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.