‘t Artikel maak deil oet vaan ‘t oonderzeuksoonderwerp “Verbetere vaan de weersjtand vaan peulvruchte tege pathogene en plaoge”, bekiek alle 5 artikele
De oerzaak vaan de necrose vaan de sjummelplantkrenkde Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary gebruuk ‘n strategie mit miedere niveaus um versjèllende gashierplante te infectere. Dit oonderzeuk stèlt ‘t gebruuk vaan ‘t diamine L-ornithine veur, ‘n neet-eiwit aminozoer dat de synthese vaan aandere essentiële aminozoere stimuleert, es ‘n alternatieve beheerstrategie um de moleculaire, fysiologische en biochemische reacties vaan Phaseolus vulgaris L. op witte sjummel veroerzaak door Pseudomonatiosclerum te verbetere. In vitro-experiminte leete zien dat L-ornithine de myceliale greuj vaan S. pyrenoidosa op ‘n dosis-aofhenkeleke meneer significant remde. Daoneve kin ‘t de ernst vaan witte sjummel oonder broeikascondities significant vermindere. Daoneve stimuleerde L-ornithine de greuj vaan de behandelde plante, wat aonguuf dat de geteste concentraties vaan L-ornithine neet fytotoxisch waore veur de behandelde plante. Daoneve verbeterde L-ornithine de expressie vaan neet-enzymatische antioxidante (totaal oplosbare fenolie en flavonoïde) en enzymatische antioxidante (catalase (CAT), peroxidase (POX) en polyfenol oxidase (PPO)), en verhoegde de expressie vaan drei antioxidant-gerelateerde gene (PVC1, PVGRAT, en PVGRAT). Daoneve onthulde in silico-analyse de aanwezigheid vaan ‘n vermeinde oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) eiwit in ‘t S. sclerotiorum-genoom, wat sterk geliek waor op de oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) eiwitte vaan Aspergillus fijiensis (AfOAH) en Penicillium sp. (PlOAH) in terme vaan functionele analyse, geconserveerde domeine en topologie. Interessant is dat de toevoeging vaan L-ornithine aon eerappeledextrosebouillon (PDB) medium de expressie vaan ‘t SsOAH-gen in S. sclerotiorum mycelia significant verminderde. Op dezelfde meneer verminderde de exogene toepassing vaan L-ornithine de expressie vaan ‘t SsOAH-gen in sjummelmycelia verzameld oet behanjelde plante. Oeteindelik verminderde de toepassing vaan L-ornithine de oxaalzuursecretie in zoewel PDB-medium es besmette blaajer significant. Concluderend, L-ornithine sjpeelt ‘n sleutelrol in ‘t behawwe vaan de redoxstatus en ‘t verbetere vaan de verdeidigingsreactie vaan besmette plante. De resultate vaan dit oonderzeuk kinne helpe bij ‘t ontwikkele vaan innovatieve, milieuvriendelike methodes um witte sjummel te behierse en de invlood devaan op de boeneproductie en aandere gewasse te vermindere.
Witte schimmel, veroerzaak door de necrotrofe sjummel Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, is ‘n verwoestende, opbringstverminderende krenkde die ‘n serieuze bedreiging vörmp veur de wereldwijde boene (Phaseolus vulgaris L.) productie (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum is ein vaan de lestigste door de bodem gedrage sjummelpathogene vaan plante um te behierse, mit ‘n breid gashierbereik vaan mie es 600 plantesoorte en ‘t meugelekheid um gashierweefsel op ‘n neet-specifieke meneer snel te macerere (Liang en Rollins, 2018). Onder ongunstige umstandighede ondergoon ‘t ‘n kritieke fase vaan zien levenscyclus, en blief ‘t langere tied slaopend es zwarte, helle, zaodachtige structure geneump ‘sclerotia’ in de groond of es witte, pluizige greuj in ‘t mycelium of de stengel vaan besmette plante (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum is in staot um sclerotia te vörme, wat ‘t in staot stelt um langere tied in besmette velde te euverleve en tijdens de krenkde te blieve (Schwartz et al., 2005). Sclerotia zien riek aan voedingstoffe, kinne lang in de groond blieve en deene es ‘t primaire inoculum veur latere infecties (Schwartz et al., 2005). Onder gunstige umstandeghede ontkieme sclerotia en producere sjpore in de loch die alle bovegróndse deile vaan de plant kinne infectere, boe-oonder mer neet beperk tot blomme, sjtengels of peul (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum gebruuk ‘n strategie mit miedere niveaus um zien gashierplante te infectere, boebij ‘n reeks gecoördineerde gebäörtenisse vaan sclerotiale ontkieming tot symptoomontwikkeling umvat. In ‘t begin produceert S. sclerotiorum gesuspendeerde sjpore (ascospore geneump) vaan paddestoelechtige structure geneump apothecia, die in de loch gaon en zich oontwikkele tot neet-beweegende sclerotia op besmette plantpuin (Bolton et al., 2006). De sjummel sjeit vervolgens oxaalzoer aof, ‘n virulentiefactor, um de pH vaan de plantcelwand te controlere, enzymatische aafbraok en weefselinvasie te bevordere (Hegedus en Rimmer, 2005) en de oxidatieve explosie vaan de gashierplant te oonderdrökke. Dit verzuringsproces verzwaak de celwand vaan de plant, wat ‘n gunstige umgeving vörmp veur de normale en efficiënte werking vaan sjummelcelwand-aafbrekende enzyme (CWDE’s), boedoor ‘t pathogeen de fysieke barrière kin euverwinne en ‘t gashierweefsel kin doordringe (Marciano et al., 1983). Es S. sclerotiorum is doorgedronge, sjeit ‘n aontal CWDE’s aof, zoe es polygalacturonase en cellulase, die de verspreijing in besmet weefsel vergemekeleke en weefselnecrose veroorzake. De veurtgang vaan laesies en hyphale matte leidt tot de karakteristieke symptome vaan witte sjummel (Hegedus en Rimmer, 2005). Ondertusse herkinne gashierplante pathogene-geassocieerde moleculaire patroene (PAMP’s) via patroenherkenningsreceptore (PRR’s), wat ‘n reeks signaolerende gebäörtenisse veroorzaak die oeteindelik defensieve reacties activere.
Ondanks decennia vaan inspanninge aon krenkdesbestrijing, blief ‘n tekort aon voldoende resistent kiemplasma in boene, zjus wie in andere commersjele gewasse, vaanwege de weersjtand, euverleving en aonpasbaarheid vaan ‘t pathogeen. Beheer vaan krenkdes is daorum extreem oetdagende en vereis ‘n geïntegreerde, multifacette strategie die ‘n combinatie vaan culturele praktijke, biologische controle en chemische fungicide umvat (O’Sullivan et al., 2021). Chemische bestrijing vaan witte sjummel is de meis effectieve, umtot fungicide, es ze correct en op ‘t gooje momint weure toegepas, de verspreijing vaan de krenkde effectief kinne controlere, de ernst vaan de infectie kinne vermindere en opbringsverluus kinne minimalisere. Echter, euvergebruuk en euveraofhankelikheid vaan fungicide kin leie tot de opkoms vaan resistente stamme vaan S. sclerotiorum en ‘n negatief effect höbbe op neet-doelorganisme, de gezondheid vaan de bodem en de kwaliteit vaan de water (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Daorum is ‘t vinde vaan milieuvriendelike alternatieve ‘n topprioriteit gewore.
Polyamines (PA’s), wie putrescine, spermidine, spermine en kadaverine, kinne dene es väölbelaovende alternatieve tege plantpathogene die in de groond weure verspreid, boedoor ‘t gebruuk vaan gevierleke chemische fungicide volledeg of gedeiltelek weurt verminderd (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). In hoegere plante zien PA’s betrokke bij väöl fysiologische processe, boe-oonder, mer neet beperk tot, celdivisie, differentiatie en reactie op abiotische en biotische stress (Killiny en Nehela, 2020). Ze kinne deene es antioxidante, helpe bij ‘t opruime vaan reactieve zuurstofsoorte (ROS), redoxhomeostase behawwe (Nehela en Killiny, 2023), verdeidegingsgerelateerde gene inducere (Romero et al., 2018), versjillende metabolische paajer regulere (Nehela en Killiny, 2023), modulere en enhormone en hormone (Nehela en Killiny, 2023). Killiny, 2019), vestige systemische verworve resistentie (SAR) en regulere plant-pathogen interacties (Nehela en Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat de specifieke mechanismes en rolle vaan PA’s in planteverdeidiging variëre aafhankelik vaan plantsoorte, pathogene en umgevingscondities. De meis euvervloedige PA in plante is gebiosynthetiseerd oet de essensjele polyamine L-ornithine (Killiny en Nehela, 2020).
L-ornithine sjpeelt mierdere rolle in de greuj en ontwikkeling vaan plante. Veurige studies höbbe beveurbeeld aongetoond dat ornithine in ries (Oryza sativa) kin weure geassocieerd mit stikstofrecycling (Liu et al., 2018), riesopbrings, kwaliteit en aroma (Lu et al., 2020) en waterstressrespons (Yang et al., 2000). Daoneve verbeterde de exogene toepassing vaan L-ornithine de dreugtetolerantie in suikerbiete (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) en verliegde de zaajtstress in ui (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu en Çavuşoǧlu, 2021) en cashena (Awccida)plant Rocha et al., 2012). De meugelike rol vaan L-ornithine in abiotische stressverdediging kin te wiete zien aon de betrokkeheid bij prolineaccumulatie in behandelde plante. Beveurbeeld, gene die gerelateerd zien aon proline metabolisme, wie ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) en proline dehydrogenase (ProDH1 en ProDH2) gene, zien eerder gerapporteerd es betrokke bij de verdediging vaan Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana tege neet-gashier Pseudomonas (Kumar-Syre-Syre-stamme, en Mysoreh 2012). Aan de andere kant is sjummel ornithine decarboxylase (ODC) nuudig veur de greuj vaan pathogene (Singh et al., 2020). ODC geriech op Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via host-geïnduceerde gene silencing (HIGS) verhoegde de weersjtand vaan tomaatplante tege Fusarium wilt (Singh et al., 2020). De meugelike rol vaan exogene ornithinetoepassing tege biotiese stress zoe wie fytopathogene is echter neet good besjtudeerd. Belangrieker nog, de effecte vaan ornithine op krenkdesresistentie en de bijbehurende biochemische en fysiologische versjijnsele blieve groetendeils neet onderzoch.
‘t Begriepe vaan de complexiteit vaan de S. sclerotiorum-infectie vaan peulvruchte is belangriek veur de ontwikkeling vaan effectieve controlestrategieje. In dit oonderzeuk wouwe we de potentiële rol vaan de diamine L-ornithine identificere es ‘n sleutelfactor in ‘t verbetere vaan de verdeidigingsmechanismes en de weersjtand vaan peulvruchte tege Sclerotinia sclerotiorum-infectie. Ver hypothesere dat, neve ‘t verbaetere vaan de verdeidegingsreacties vaan besmette plante, L-ornithine ouch ‘n sleutelrol sjpeelt in ‘t behawwe vaan de redoxstatus. Ver stèlle veur dat de potentiële effecte vaan L-ornithine gerelateerd zien aon de regulering vaan enzymatische en neet-enzymatische antioxidant verdeidigingsmechanismes en inmenging mèt sjummelpathogeniciteit/virulentiefactore en geassocieerde eiwitte. Deze dubbele functionaliteit vaan L-ornithine maak ‘t ‘n väölbelaovende kandidaat veur ‘n duurzame strategie um de impact vaan witte sjummel te vermindere en de weersjtand vaan gewone peulgewasse tege dit krachtige sjummelpathogeen te vergroete. De resultate vaan de huidige studie kinne helpe bij de ontwikkeling vaan innovatieve, milieuvriendelike methodes um witte sjummel te behierse en de invlood devaan op de productie vaan peulvruchte te vermindere.
In dit oonderzeuk woort ‘n geveulige commerciële variëteit vaan gewone boene, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), gebruuk es experimenteel materiaal. Gezoond zaode woorte vriendelik veurzeen door ‘t Afdeiling Oonderzeuk nao Peulvruchte, ‘t Oonderzeuksinstituut veur Veldgewasse (FCRI), ‘t Landbouwoonderzeukscentrum (ARC), Egypte. Vijf zaode woorte gezaai in plastic potte (binnediameter 35 cm, deepte 50 cm) gevuld mit S. sclerotiorum-besmette groond in broeikas (25 ± 2 °C, relatieve vochtigheid 75 ± 1%, 8 oor leech/16 oor duuster). Op 7-10 daag nao ‘t zaaie (DPS) woorte de zaailinge verdun zodat mer twie zaailinge mit uniforme greuj en drei volledig oetgebreide blaajer in eder pot bleve. Alle potplante woorte einmaol um de twie weke gewaterd en elke maond bevruch tege de aonbevole snelheid veur de gegeve variëteit.
Um ‘n concentratie vaan 500 mg/L L-ornithinediamine (ouch bekind es (+)-(S)-2,5-diaminopentanoïnezuur; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) te bereide, woort 50 mg iers opgelos in 100 mL steriel gedestilleerd water. De veurraodsoplossing woort vervolgens verdunt en gebruuk in volgende experiminte. Kort samegevat, zes serie L-ornithineconcentraties (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) woorte in vitro getes. Daoneve woort steriel gedestilleerd water gebruuk es negatieve controle (Mock) en commercieel fungicide “Rizolex-T” 50% benatbaar poeder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governor, Egy) woort gebruuk es positieve controle. Commercieel fungicide “Rizolex-T” woort in vitro getes op vijf concentraties (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L).
Monsters vaan gewone boenestengels en peul die typische symptome vaan witte sjummel vertoende (besmettingspercentage: 10-30%) woorte verzameld vaan commerciële boerderije. Alhoewel de mieste besmette plantmateriale woorte geïdentificeerd op soorte/variëteit (gevoelige commerciële variëteit Giza 3), waore aandere, veural die die woorte verkrege op lokale merrete, vaan onbekinde soorte. De verzamelde besmette materiale woorte iers op ‘t oppervlak gedesinfecteerd mit 0,5% natriumhypochlorietoplossing veur 3 minute, daonao mierdere kiere gespoeld mit steriel gedestilleerd water en druug geveerd mit steriel filterpapier um euvertollige water te verwijdere. De besmette organe woorte vervolgens in klein stukke oet ‘t middelste weefsel (tusse gezond en besmette weefsel) gesneje, gekweek op potato-dextrose-agar (PDA)-medium en geïncubeerd bij 25 ± 2 °C mit ‘n 12 oor leech/12 oor duuster cyclus veur 5 daog um de vorming vaan sclerotia te stimulere. De myceliale tipmethode woort ouch gebruuk um sjummel-isolate vaan gemengde of besmette kweek te zuivere. ‘t Gezuuverde sjummel-isolaat woort iers geïdentificeerd op basis vaan zien culturele morfologische kinmerke en vervolgens bevesteg es S. sclerotiorum op basis vaan microscopische kinmerke. Oeteindelik woorte alle gezuuverde isolate getes op pathogeniciteit op de geveulige gewone bonencultivar Giza 3 um aon de postulate vaan Koch te voldoon.
Daoneve woort ‘t meis invasieve S. sclerotiorum-isolaat (isolaat #3) wiejer bevesteg op basis vaan interne getranscribed spacer (ITS) sequensjering zoewie besjreve door White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kort samegevat, isolate woorte gekweek in aarpeldextrosebouillon (PDB) en geïncubeerd bij 25 ± 2 °C veur 5-7 daog. Sjummelmycelium woort vervolgens verzameld, door kaasdoek gefilterd, twie kier gewasse mit steriel water en gedroog mit steriel filterpapier. Genomisch DNA woort geïsoleerd met behölp vaan de Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ‘t ITS rDNA-regio woort vervolgens geamplificeerd mit behulp vaan ‘t specifieke primerpaar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; verwachte gruutde: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). De gezuuverde PCR-produkte woorte ingediend veur sequensjering (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). De ITS rDNA-sequenties woorte twieriechtingsgesequentierd met behölp vaan de Sanger-sequentiemethode. De samegevoegde zeukopdrachsequenties woorte vervolgens vergeleke mit de mies recente data in GenBank en ‘t National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) mit behulp vaan BLASTn-software. De query-sequentie woort vergeleke mit 20 aandere S. sclerotiorum-stamme/isolate die woorte opgehaold oet de mies recente data in NCBI GenBank (Aonvullende Tabel S1) met behulp vaan ClustalW in ‘t Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; versie 11) (Kumar et al., 2024). Evolutionaire analyse woort oetgeveurd met behulp vaan de maximum woersjienlikheidsmethode en ‘t algemein tied-reversibele nucleotidevervangingsmodel (Nei en Kumar, 2000). De boum mit de hoegste log-kans weurt getoend. De ierste boum veur de heuristische zeuktoch weurt geselecteerd door de boum mit de hoegere log-kans te keze tösse de neighbor-joining (NJ) boum (Kumar et al., 2024) en de maximum parsimony (MP) boum. De NJ-boum woort geconstrueerd met behölp vaan ‘n paarwieze aafstandsmatrix beraekend mit behölp vaan ‘t algemein tied-reversibel model (Nei en Kumar, 2000).
De antibacteriële activiteit vaan L-ornithine en ‘t bactericide “Rizolex-T” woort in vitro bepaold door de agardiffusiemethode. Methode: Neem de gepaste hoeveelheid vaan de voorraodoplossing vaan L-ornithine (500 mg/L) en meng ‘t grondig mèt 10 ml vaan ‘t PDA-voedingsmedium um oplossinge veur te bereide mèt eindconcentraties vaan 12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L, respectievelik. Vief concentraties vaan ‘t fungicide “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L) en steriel gedestilleerd water woorte es controle gebruuk. Naodat ‘t medium waor gestold, woort ‘n vers bereide myceliumplug vaan Sclerotinia sclerotiorum-kweek, 4 mm in diameter, nao ‘t midde vaan de Petri-sjaol euvergedrage en gekweek op 25±2°C totdat ‘t mycelium de ganse controle-Petri-sjaol bedèkde, boenao de sjummelgreuj woort geregistreerd. Bereken ‘t percentaasj remming vaan radiale greuj vaan S. sclerotiorum mèt behulp vaan vergelieking 1:
‘t Experimint woort twie kier herhaold, mit zès biologische herhaolinge veur eder controle-/experimentele groep en vijf potte (twie plante per pot) veur eder biologische herhaling. Iedere biologische replica woort twie kier geanalyseerd (twie technische replicate) um de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid vaan de experimentele resultate te verzekere. Daoneve woort probit-regressieanalyse gebruuk um de haaf-maximale remmende concentratie (IC50) en IC99 (Prentice, 1976) te berekene.
Um ‘t potentieel vaan L-ornithine in broeikascondities te evaluere, woorte twie opeinvolgende pot-experimente oetgeveurd. Kort samegevat, woorte potte gevöld mit gesteriliseerde klei-zandgrond (3:1) en geïnfecteerd mit un verse bereide kweek vaan S. sclerotiorum. Iers woort ‘t meis invasieve isolaat vaan S. sclerotiorum (isolaat #3) gekweek door ein sclerotium door de helft te snijje, ‘t mèt ‘t gezich nao oonder op ‘n PDA te lègke en 4 daog laank bij 25°C in constante duusternis (24 oor) te incubere um myceliumgreuj te stimulere. Vervolgens woorte veer agarplugs mit ‘n diameter vaan 5 mm oet de veurkant gehaold en geïnfecteerd mit 100 g vaan ‘n steriel mengsel vaan tarf en rieszemele (1:1, v/v) en alle kolve woorte geïncubeerd bij 25 ± 2 °C oonder ‘n 12 oor leech/12 oor duuster cyclus veur 5 daog um de vörming vaan sclerotia te stimulere. De inhoud vaan alle kolve woort gróndeg gemengk um de homogeniteit te verzekere veurtot de grónd woort touwgeveug. Daonao woort 100 g vaan ‘t koloniserende zemelemengsel aon eder pot toegevoog um ‘n constante concentratie vaan pathogene te verzekere. De geïnfecteerde potte woorte gewaterd um sjummelgreuj te activere en 7 daog in broeikas gezat.
Vief zaode vaan de Giza 3-variëteit woorte daonao in eder pot gezaai. Veur de potte die behanjeld woorte mit L-ornithine en ‘t fungicide Rizolex-T, woorte de gesteriliseerde zaode iers twie oor laank in ‘n waterige oplossing vaan de twie verbindinge geweek mit ‘n eind IC99-concentratie vaan ongeveer 250 mg/L en 50 mg/L, respectievelik, en vervolgens eine oor laank in de loch gedroog veur ‘t zaaje. Aan de andere kant woorte de zaode es negatieve controle in steriel gedestilleerd water geweek. Nao 10 daag, veur de ierste watering, woorte de zaailinge oetgedun, zoetot mer twie nette zaailinge in eder pot bleve. Um de infectie mit S. sclerotiorum te verzekere, woorte boonplantstengels in ‘tzelfde ontwikkelingsfase (10 daog) op twie versjillende locaties gesjneje mit behölp vaan ‘n gesteriliseerde scalpel en woort ongeveer 0,5 g vaan ‘t koloniserende zemelemengsel in eder wónd geplaots, gevolg door ‘n hoege vochtigheid um de infectie te stimulere en alle besmette plante. Controleplante woorte op dezelfde meneer gewond en ‘n gelieke hoeväölheid (0,5 g) vaan steriel, neet gekoloniseerd zemelemengsel woort in de wond geplaots en oonder hoege vochtigheid gehandhaaf um de umgeving veur krenkdesontwikkeling te simulere en consistentie tusse behanjelingsgróppe te verzekere.
Behandelingsmethode: Boonzaailinge woorte gewaterd mit 500 ml vaan ‘n waterige oplossing vaan L-ornithine (250 mg/l) of ‘t fungicide Rizolex-T (50 mg/l) door de groond te irrigere, en de behandeling woort daonao drei kier herhaold mit ‘n interval vaan 10 daog. De met placebo behandelde controle woorte geïrrigeerd mit 500 ml steriel gedestilleerd water. Alle behandelinge woorte oetgeveurd in broeikascondities (25 ± 2°C, 75 ± 1% relatieve vochtigheid en un fotoperiood vaan 8 oor leech/16 oor duuster). Alle potte woorte um twie weke gewaterd en maondeliks behandeld mit ‘n gebalanceerde NPK-meststof (20-20-20, mit 3,6% zwavel en TE-microelemente; Zain Seeds, Egypte) in ‘n concentratie vaan 3-4 g/l door blaajer te spuite volgens de aanbevelinge veur de specifieke variëteit en de instructies vaan de productie. Tenzij anders vermeld, woorte volledig oetgebreide volwasse blaajer (2e en 3e blaajer vaanaof de bovekant) verzameld vaan eder biologisch replicaat 72 oor nao de behandeling (hpt), gehomogeniseerd, samegevoeg en bewaard bij -80 °C veur weijer analyses, boe-oonder, mer neet beperk tot, in situ histochemische lokalisatie vaan oxidatieve stressindicatore, peroxidatie en enzymatische indicatore neet-enzymatische antioxidante en genexpressie.
De intensiteit vaan de witte sjummelinfectie woort wekeleks 21 daag nao de inoculatie (dpi) beoordeild met behulp vaan ‘n sjaol vaan 1-9 (Aonvullende Tabel S2) gebaseerd op de Petzoldt- en Dickson-sjaol (1996) aongepas door Teran et al. (2006). Kort samegevat, de stengels en takke vaan bonenplante woorte oonderzoch vanaaf ‘t punt vaan inoculatie um de progressie vaan de laesies langs tusseknoop en knoop te volge. De aafsjtand vaan de laesie vaan ‘t punt vaan inoculatie tot ‘t wiedste punt langs de stam of tak woort daonao gemete en ‘n score vaan 1-9 woort touwgeweze op basis vaan de locatie vaan de laesie, boebij (1) gein ziechtbare infectie in de buurt vaan ‘t punt vaan insetting aonguuf en (2-9) ‘n geleideleke touwnaome in de laesiegrootte en progressie langs tusseknope/aanvullinge aongief (Tabel S2). De intensiteit vaan de witte sjummelinfectie woort daonao umgerekend nao percentaasj met behölp vaan formule 2:
Daoneve woort ‘t oppervlak oonder de krenkdeprogressiecurve (AUDPC) beraekend met behulp vaan de formule (Shaner en Finney, 1977), die onlangs is aongepas veur witte rot vaan gewone boene (Chauhan et al., 2020) met behulp vaan vergelieking 3:
Boe Yi = de ernst vaan de krenkde op tied ti, Yi+1 = de ernst vaan de krenkde op de volgende tied ti+1, ti = tied vaan de ierste meting (in daog), ti+1 = de tied vaan de volgende meting (in daog), n = ‘t totaal aontal tiedpunte of observatiepunte. De greujparameters vaan boneplante, boe-oonder de huugte vaan de plant (cm), ‘t aontal takke per plant en ‘t aontal blaajer per plant, woorte 21 daog laank wekelijks geregistreerd in alle biologische herhaolinge.
In eder biologisch replica woorte blaajermonsters (twiede en derde volledig oontwikkelde blaajer vaanaof de bovekant) verzameld op daag 45 nao de behandeling (15 daag nao de lètste behandeling). Iedere biologische replica bestoont oet vijf potte (twie plante per pot). Ongeveer 500 mg vaan ‘t gemalen weefsel woort gebruuk veur de extractie vaan fotosynthetische pigmente (chlorofyl a, chlorofyl b en carotenoïde) mèt 80% acetoon bij 4 °C in ‘t duuster. Nao 24 oor woorte de monsters gecentrifugeerd en ‘t supernatant woort verzameld veur de bepaoling vaan de chlorofyl a, chlorofyl b en carotenoïde-inhoud colorimetrisch met behölp vaan ‘n UV-160A-spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) volgens de methode vaan (Lichtenthaler, 1987) door de absorptie vaan de golflengte te mete op versjèllende lengtes (A470, A646 en A663 nm). Oeteindelik woort de inhoud vaan fotosynthetische pigmente beraekend met behulp vaan de volgende formules 4-6 besjreve door Lichtenthaler (1987).
Nao 72 oor nao de behandeling (hpt) woorte blaajer (twiede en derde volledig oontwikkelde blaajer vaanaof de bovekant) verzameld vaan eder biologisch replica veur in situ histochemische lokalisatie vaan waterstofperoxide (H2O2) en superoxideanion (O2•−). Iedere biologische replica bestoont oet vijf potte (twie plante per pot). Iedere biologische replica woort in dubbelt geanalyseerd (twie technische replicate) um de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid vaan de methode te garandere. H2O2 en O2•− woorte bepaold mit behulp vaan 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) of nitroblauw tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duutsjland), respectievelik, volgens de methodes besjreve door Romero-Puertas et al. (2004) en Adam et al. (1989) mit kleine aanpassinge. Veur de histochemische lokalisatie vaan H2O2 in situ woorte blaajer vacuüm geïnfiltreerd mit 0,1% DAB in 10 mM Tris-buffer (pH 7,8) en vervolgens 60 min bij kamertemperatuur in ‘t leech geïncubeerd. Blaadjes woorte gebleek in 0,15% (v/v) TCA in 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypte) en vervolgens blootgesjtild aan leech tot ze verduusterde. Op dezelfde meneer woorte kleppe vacuüm geïnfiltreerd mit 10 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,8) mit 0,1 w/v % HBT veur histochemische lokalisatie vaan O2•− in situ. De blaajer woorte 20 min in ‘t leech bij kamertemperatuur geïncubeerd, vervolgens gebleek wie heibove, en vervolgens verlich totdat doonkerblauw/violette vlekke versjene. De intensiteit vaan de resulterende broen (es H2O2-indicator) of blauw-violet (es O2•−-indicator) kleur woort beoordeild met behölp vaan de Fiji-versie vaan ‘t beeldverwerkingspakket ImageJ (http://fiji.sc; bekroond op 7 maart 2024).
Malondialdehyde (MDA; es marker vaan lipideperoxidatie) woort bepaold volgens de methode vaan Du en Bramlage (1992) mèt kleine aonpassinge. Blaajer vaan eder biologisch replicaat (twiede en derde volledig oontwikkelde blaajer vaanaof de bovekant) woorte 72 oor nao de behandeling (hpt) verzameld. Iedere biologische replica bevatte vijf potte (twie plante per pot). Iedere biologische replica woort in dubbelt geanalyseerd (twie technische replicate) um de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid vaan de methode te garandere. Kort samegevat, 0,5 g gemaalde blaajerweefsel woort gebruuk veur MDA-extractie mit 20% trichlorazienzoer (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, VS) mit 0,01% gebutyleerd hydroxytolueen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS). De MDA-inhoud in ‘t supernatant woort vervolgens colorimetrisch bepaold door de absorptie op 532 en 600 nm te maete mit behulp vaan ‘n UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) en vervolgens oetgedruk es nmol g−1 FW.
Veur de beoordeiling vaan neet-enzymatische en enzymatische antioxidante woorte blaajer (twiede en derde volledig oontwikkelde blaajer vaanaof de bovekant) verzameld vaan eder biologisch replicaat 72 oor nao de behandeling (hpt). Iedere biologische replica bestoont oet vijf potte (twie plante per pot). Eder biologisch monster woort in dubbelt (twie technische monsters) geanalyseerd. Twee blaajer woorte gemalen mit vloeibaar stikstof en direk gebruuk veur de bepaoling vaan enzymatische en neet-enzymatische antioxidante, totale aminozure, proliengehalte, genexpressie en oxalaatkwantificatie.
Totaal oplosbare fenolieke woorte bepaold met behölp vaan Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) mit kleine aanpassinge vaan de methode besjreve door Kahkonen et al. (1999). Kort samegevat, ongeveer 0,1 g gehomogeniseerd blaarweefsel woort 24 oor in ‘t duuster geëxtraheerd mèt 20 ml 80% methanol en ‘t supernatant woort nao centrifugatie verzameld. 0,1 ml vaan ‘t monsterextract woort gemengk mit 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10%), 30 s gesjood en 5 min in ‘t duuster gelaote. Daonao woort 0,5 ml vaan 20% natriumcarbonaat-oplossing (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypte) toegeveug aon eder buis, gróndeg gemengk en 1 oor bij kamertemperatuur in ‘t duuster geïncubeerd. Nao de incubatie woort de absorptie vaan ‘t reactiemengsel gemete op 765 nm met behulp vaan ‘n UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De concentratie vaan totale oplosbare fenole in de monsterextracte woort bepaold mit behulp vaan ‘n gallieszuur kalibratiecurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, VS) en oetgedruk es milligramme vaan gallieszuur equivalent per gram verse gewiech (mg GAE g-1 verse gewiech).
De totale oplosbare flavonoïdegehalte woort bepaold volgens de methode vaan Djeridane et al. (2006) mit kleine aanpassinge. Kort samegevat, 0,3 ml vaan ‘t bovestaonde methanolextract woort gemengk mit 0,3 ml vaan 5% aluminiumchloride-oplossing (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, VS), krachtig geroerd en vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 min, gevolg door de toevoeging vaan 0,3 ml vaan 0,3 ml vaan 0,0% asiumkalium-oplossing. (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypte), grondig gemengk en geïncubeerd bij kamertemperatuur veur 30 min in ‘t duuster. Nao incubatie woort de absorptie vaan ‘t reactiemengsel gemete op 430 nm met behulp vaan ‘n UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De concentratie vaan totale oplosbare flavonoïde in steekproefextracte woort bepaold met behulp vaan ‘n routine-kalibreringscurve (TCI America, Portland, OR, VS) en vervolgens oetgedruk es milligramme vaan routine-equivalent per gram verse gewiech (mg RE g-1 verse gewiech).
‘t Totaal vrije aminozuurgehalte vaan boeneblaajer woort bepaold met behulp vaan ‘n gemodificeerd ninhydrinereagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS) gebaseerd op de methode veurgesjtèld door Yokoyama en Hiramatsu (2003) en gemodificeerd door Sun et al. (2006). Kort samegevat, 0,1 g gemalen weefsel woort geëxtraheerd mit pH 5,4 buffer, en 200 μL vaan ‘t supernatant woort gereageerd mèt 200 μL ninhydrine (2%) en 200 μL pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, VS), geïncubeerd in ‘n kokend waterbad en vervolgens gekoeld op 580 nm mit behulp vaan un UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Aan de andere kant woort proline bepaold door de Bates-methode (Bates et al., 1973). Proline woort geëxtraheerd mit 3% sulfosalicylies zoer (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS) en nao centrifugatie woort 0,5 ml vaan ‘t supernatant gemengk mit 1 ml glaciaal azienzoer (Fisher Scientific, Hampton, NH, VS) en ninhydrine-reagent, geïncubeerd op 90°C en geminuleerd veur gecool gemete op 520 nm mit behulp vaan dezelfde spectrofotometer es heibove. Totaal vrije aminozure en proline in de blaajerextracte woorte bepaold met behulp vaan respectievelik glycine- en prolinekalibreringscurves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS), en oetgedruk es mg/g verse gewiech.
Um de enzymatische activiteit vaan antioxidante enzyme te bepaole, woort ongeveer 500 mg gehomogeniseerd weefsel geëxtraheerd mèt 3 ml vaan 50 mM Tris-buffer (pH 7,8) bevattende 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en 7,5% polylpyllidon (PH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS), gecentrifugeerd op 10.000 × g veur 20 min onder koeling (4 °C), en ‘t supernatant (ruwe enzymextract) woort verzameld (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Catalase (CAT) woort daonao gereageerd mit 2 ml vaan 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en 100 μl vaan 269 mM H2O2-oplossing um de enzymatische activiteit te bepaole volges de methode vaan Aebi (1984) mèt slight-modificaties (Elgar-Nagar et al. 2023; Osman et al., 2023). De enzymatische activiteit vaan Guaiacol-dependent peroxidase (POX) woort bepaold met behulp vaan de methode vaan Harrach et al. (2009). (2008) mit kleine modificaties (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) en de enzymatische activiteit vaan polyfenol oxidase (PPO) woort bepaold nao reactie mèt 2,2 ml vaan 100 mM natriumfosfaatbuffer (pH 600 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6,00 ml) vaan chemische stoffe. Portland, OR, VS) en 100 μl vaan 12 mM H2O2. De methode is get aongepas vaan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). De testing woort oetgeveurd nao reactie mit 3 ml catechol-oplossing (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS) (0,01 M) vers bereid in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,0). CAT-activiteit woort gemete door de ontbinding vaan H2O2 op 240 nm (A240) te monitore, POX-activiteit woort gemete door de touwnaome in absorptie op 436 nm (A436) te monitore, en PPO-activiteit woort gemete door absorptieschommelinge op 495 nm (A495) um de 30 min veur 30 s op te neume veur ‘n UV-160-Aspectometer. (Shimadzu, Japan).
Real-time RT-PCR woort gebruuk um de transcriptniveaus vaan drei antioxidant-gerelateerde gene te detectere, boe-oonder peroxisomale catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxidedismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_06863955), en glutase reductase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1). Toegang No. KY195009.1), in bonenblaajer (de twiede en derde volledig oontwikkelde blaajer vaanaof de bovekant) 72 oor nao de lètste behandeling. Kort samegevat, RNA woort geïsoleerd met behölp vaan Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) volgens ut protocol vaan de fabrikant. Daonao woort cDNA gesynthetiseerd mit behulp vaan TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit volgens de instructies vaan de fabrikant. De primersequenties vaan de bovestaonde drei gene zien vermeld in Supplementary Tabel S3. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) woort gebruuk es ‘t housekeeping gen en de relatieve genexpressie woort beraekend met behulp vaan de 2-ΔΔCT-methode (Livak en Schmittgen, 2001). Actinestabiliteit oonder biotische stress (incompatibele interactie tusse gewoene peulvruchte en de anthracnose-sjummel Colletotrichum lindemuthianum) en abiotische stress (dreugte, ziutgehalte, liege temperatuur) woort aongetoond (Borges et al., 2012).
Ver höbbe in ‘t begin ‘n genoom-wide in silico-analyse oetgeveurd vaan oxaloacetaat acetylhydrolase (OAH) eiwitte in S. sclerotiorum met behulp vaan ‘t eiwit-eiwit BLAST-hulpmiddel (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kort samegevat, we gebruukde OAH vaan Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 aminozure) en Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 942181; GenBank accession number; XP_056833920.1; 316 aminozure) es query-sequenties um ‘t homoloog eiwit in S. sclerotiorum (taxide: 5180) in kaart te bringe. BLASTp woort oetgeveurd tege de meis recent besjikbare S. sclerotiorum-genoomdata in GenBank op de website vaan ‘t National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Daoneve woorte ‘t veurspelde OAH-gen vaan S. sclerotiorum (SsOAH) en de evolutionaire analyse en fylogenetische boum vaan AfOAH vaan A. fijiensis CBS 313.89 en PlOAH vaan P. lagena aafgeleid met behulp vaan de maximum woersjijnelekheidsmethode in MEGA11 (Tamura et al., 2021) en ‘t JTT-gebaseerde model (JTT et al. al., 1992). De fylogenetische boum woort gecombineerd mit de multiple alignment-analyse vaan eiwitsequenties vaan alle veurspelde OAH-gene (SsOAH) vaan S. sclerotiorum en de query-sequentie met behulp vaan de Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools//cobalt_cobalt) Agarwala, 2007). Daonaeve woorte de beste bijpassende aminozoersequenties vaan SsOAH vaan S. sclerotiorum gealigneerd mèt de querysequenties (AfOAH en PlOAH) (Larkin et al., 2007) met behulp vaan ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), en geconserveerde regio’s woorte gealigneerd in ‘t ESP tool (versie 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Daoneve woorte de veurspelde functionele representatieve domeine en geconserveerde locaties vaan S. sclerotiorum SsOAH interactief geclassificeerd in versjèllende femilies mèt behulp vaan ‘t InterPro-hulpmiddel (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Oeteindelik woort driedimensionale (3D) structuurmodellering vaan de veurspelde S. sclerotiorum SsOAH oetgeveurd met behulp vaan de Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server versie 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cid=x) (Kelley et al., et al. 2015) en gevalideerd mit de SWISS-MODEL-server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De veurspelde drei-dimensionale structure (PDB-formaat) woorte interactief gevisualiseerd met behölp vaan ut UCSF-Chimera-pakket (versie 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Kwantitatieve real-time fluorescentie PCR woort gebruuk um ‘t transcriptieniveau vaan oxaloacetaat acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) in de mycelia vaan Sclerotinia sclerotiorum te bepaole. Kort samegevat, S. sclerotiorum woort geïnfecteerd in un kolf mit PDB en geplaats in un sjudde incubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VS) bij 25 ± 2 °C veur 24 oor bij 150 rpm en in constante duusternis (24 oor) um de greuj vaan mycel te stimulere. Daonao woorte de celle behandeld mit L-ornithine en ‘t fungicide Rizolex-T bij eindconcentraties vaan IC50 (ongeveer 40 en 3,2 mg/L, respectievelik) en vervolgens nog ‘ns 24 oor oonder dezelfde umstandeghede gekweek. Nao de incubatie woorte de kweek gecentrifugeerd bie 2500 rpm veur 5 min en woort ‘t supernatant (sjummelmycelium) verzameld veur genexpressieanalyse. Op dezelfde meneer woort sjummelmycelium verzameld op 0, 24, 48, 72, 96 en 120 oer nao de infectie vaan besmette plante die witte sjummel en ketoenachtig mycelium op ‘t oppervlak vaan besmette weefsels hadde gevörmp. RNA woort geëxtraheerd oet ‘t sjummelmycelium en vervolgens woort cDNA gesynthetiseerd wie heibove besjreve. De primersequenties veur SsOAH zien vermeld in Supplementary Tabel S3. SsActine (GenBank accession number: XM_001589919.1) woort gebruuk es ‘t housekeeping-gen, en de relatieve genexpressie woort beraekend met behulp vaan de 2-ΔΔCT-methode (Livak en Schmittgen, 2001).
Oxaalzuur woort bepaold in aardappeldextrosebouillon (PDB) en plantmonsters die ‘t sjummelpathogeen Sclerotinia sclerotiorum bevatte volgens de methode vaan Xu en Zhang (2000) mit kleine aanpassinge. Kort samegevat, S. sclerotiorum-isolate woorte geïnfecteerd in kolve mit PDB en vervolgens gekweek in un schudden incubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VS) bij 150 rpm bij 25 ± 2 °C veur 3-5 daog in constante duusternis (24 h) um de greuj vaan mycel te stimulere. Nao de incubatie woort de sjummelkweek iers gefilterd door Whatman #1 filterpapier en vervolgens gecentrifugeerd mit 2500 rpm veur 5 min um ut res vaan mycelium te verwijdere. ‘t Supernatant woort verzameld en bewaard bij 4°C veur wijere kwantitatieve bepaoling vaan oxalaat. Veur de veurbereijing vaan plantmonsters woorte ongeveer 0,1 g plantweefselfragminte drei kier geëxtraheerd mèt gedestilleerd water (edere kier 2 ml). De monsters woorte vervolgens gecentrifugeerd mit 2500 rpm veur 5 min, de supernatant woort druug gefilterd door Whatman No. 1 filterpapier en verzameld veur weijer analyse.
Veur de kwantitatieve analyse vaan oxaalzoer woort ‘t reactiemengsel in ‘n glassjtop in de volgende volgorde veurbereid: 0,2 ml monster (of PDB-kweekfiltraat of oxaalzuur standaardoplossing), 0,11 ml bromofenolblauw (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, VS, Ml 1919), Ml. zwavelzuur (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypte) en 0,176 ml vaan 100 mM kaliumdichromaat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, VS), en daonao woort de oplossing verdunt tot 48 mM verdund water, krachtig gemengd. onmiddellik in un waterbad mit 60 °C gezat. Nao 10 min woort de reactie gestop door 0,5 ml natriumhydroxide-oplossing (NaOH; 0,75 M) toe te voge. De absorptie (A600) vaan ‘t reactiemengsel woort gemaete op 600 nm met behulp vaan ‘n UV-160 spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB en gedestilleerd water woorte gebruuk es controles veur de kwantificering vaan kweekfiltrate en plantmonsters, respectievelik. De concentraties vaan oxaalzuur in de kweekfiltrate, oetgedruk es microgramme oxaalzuur per milliliter PDB-medium (μg.mL−1), en in de blaajerextracte, oetgedruk es microgramme oxaalzuur per gram verse gewiech (μg.g−1 FW), woorte bepaold met behölp vaan ‘n oxaalzoercurve (The Firrs Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS).
Gedurende de ganse studie woorte alle experiminte ontworpe in un volledig gerandomiseerd oontwerp (CRD) mit zes biologische herhaolinge per behandeling en vief potte per biologische herhaolinge (twie plante per pot), tenzij anders vermeld. Biologische replicate woorte in dubbelt geanalyseerd (twie technische replicate). Technische herhaolinge woorte gebruuk um de reproduceerbaarheid vaan ‘tzelfde experimint te controlere, mer woorte neet gebruuk in de statistische analyse um valse herhaolinge te veurkomme. Gegevens woorte statistisch geanalyseerd mit behulp vaan variantieanalyse (ANOVA) gevolg door de Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0,05). Veur in vitro-experiminte woorte IC50- en IC99-waardes beraekend met behulp vaan ‘t probit-model en woorte 95% vertrouwesintervalle beraekend.
In totaal woorte veer isolate verzameld oet versjillende sojavelde in ‘t gouvernement El Ghabiya, Egypte. Op PDA-medium produceerde alle isolate romerig wit mycelium dat snel katoenwit woort (Figuur 1A) en daonao beige of broen in ‘t sclerotiumstadium. Sclerotia zien meistal dich, zwart, bolvormig of onregelmaotig vaan vörm, 5,2 tot 7,7 mm laank en 3,4 tot 5,3 mm in diameter (Figuur 1B). Alhoewel veer isolate ‘n marginaal patroon vaan sclerotia oontwikkelde aon de rand vaan ‘t kweekmedium nao 10-12 daog vaan incubatie bij 25 ± 2 °C (Afb. 1A), waor ‘t aontal sclerotia per plaat significant versjèllend oonder hun (P < 0,001), boebij isolaat 3 ‘t hoegste aontal sclerotia had (333 ± 33). sclerotia per plaat; Fig. 1C). Op dezelfde meneer produceerde isolaat #3 mie oxaalzuur in PDB es andere isolate (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolaat #3 leet typische morfologische en microscopische kinmerke zien vaan de fytopathogene sjummel Sclerotinia sclerotiorum. Op PDA greujde kolonies vaan isolaat #3 beveurbeeld snel, waore romerig wit (Figuur 1A), umgedrejd beige of liech zalmgeel-broen, en hadde 6-7 daog nuudig bij 25 ± 2°C um ‘t oppervlak vaan ‘n plaat vaan 9 cm doorsnee volledeg te bedekke. Op basis vaan de bovestaonde morfologische en microscopische kenmerke woort isolaat #3 geïdentificeerd es Sclerotinia sclerotiorum.
Figuur 1. Kenmerke en pathogeniciteit vaan S. sclerotiorum-isolate oet gewone peulgewasse. (A) Myceliale greuj vaan veer S. sclerotiorum-isolate op PDA-medium, (B) sclerotië vaan veer S. sclerotiorum-isolate, (C) aontal sclerotië (per plaat), (D) oxaalzuursecretie op PDB-medium (μg.mL−1), en (E) de ernst vaan de krenkde (%) vaan veer S. sclerotiorum-isolate op commerciale sclerotiorum-gevoelige bein. cultivar Giza 3 in broeikascondities. Waardes representere ‘t gemiddelde ± SD vaan vief biologische herhaolinge (n = 5). Versjèllende lètters geve statistisch significante versjille tusse behandelinge aon (p < 0,05). (F–H) Typische witte sjummelsymptome versjene op bovegróndse stengels en silique, respectievelik, 10 daog nao de inoculatie mit isolaat #3 (dpi). (I) Evolutionaire analyse vaan ‘t interne getranscribeerde spacer (ITS) regio vaan S. sclerotiorum isolaat #3 woort oetgeveurd mèt behulp vaan de maximum likelihood methode en vergeleke mèt 20 referentie-isolate/stamme verkriege oet de National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.h.v./). De getalle baove de clusterlijne geve de regiobedekking (%) aan, en de getalle oonder de clusterlijne geve de taklengte aan.
Um de pathogeniciteit te bevestige, woorte veer verkrege S. sclerotiorum-isolate gebruuk um de geveulige commerciële bonencultivar Giza 3 in broeikascondities te inoculere, wat euvereinkump mit de postulate vaan Koch (Afb. 1E). Alhoewel alle verkrege sjummel-isolate pathogeen waore en de greune boon kooste infectere (cv. Giza 3), wat typische witte sjummelsymptome veroerzaakde op alle bovegróndse deile (afb. 1F), veural op de stengels (afb. 1G) en peul (afb. 1H) 10 daog nao de inoculatie), waor ‘t isolaat ‘t isolaat meis agressief twie oonaofhenkeleke experiminte. Isolaat 3 had de hoegste ernst vaan de krenkde (%) op bonenplante (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 en 76,7 ± 3,1 op respectievelik 7, 14 en 21 daog nao de infectie; Figuur 1F).
De identificatie vaan ‘t meis invasieve S. sclerotiorum-isolaat #3 woort weijer bevesteg op basis vaan interne getranscribed spacer (ITS) sequensjering (Fig. 1I). Fylogenetische analyse tusse isolaat #3 en 20 referensie-isolate/stamme leet ‘n groete euvereinkoms (>99%) tusse ze zien. ‘t Is de moeite waord um op te merke dat ‘t S. sclerotiorum-isolaat #3 (533 bp) ‘n groete geliekenis heet mit ‘t Amerikaanse S. sclerotiorum-isolaat LPM36 geïsoleerd oet druige erwtezaode (GenBank-toetreednummer MK896659.1; 540 bp) en ‘t Chinese S. sclerotiorum-isolaat YK896659.1; 540 bp) en ‘t Chinese S. sclerotiorum-isolaat YK896659.1; OR206374.1; 548 bp), wat violet (Matthiola incana) stamrot veroorzaak, die allemaol apaart bovenaon ‘t dendrogram zien gegroepeerd (Figuur 1I). De nuuje sequentie is in de NCBI-database gedeponeerd en is geneump “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792). ‘t Kin weure gezeen dat isolaat 3 ‘t meis invasieve isolaat is; daorum woort dit isolaat gekoze veur oonderzeuk in alle daoropvolgende experiminte.
De antibacteriële activiteit vaan de diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) in versjèllende concentraties (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) tege S. sclerotiorum isolaat 3 woort in vitro oonderzeuk. ‘t Is opmerkelik dat L-ornithine ‘n antibacterieel effek oetoefende en geleidelek de radiale greuj vaan S. sclerotiorum-hyphae op ‘n dosis-aafhankeleke meneer remde (Figuur 2A, B). Bie de hoegste geteste concentratie (125 mg/L) toonde L-ornithine de hoegste myceliale greujremmingspercentage (99,62 ± 0,27%; Figuur 2B), wat geliek waor aon ‘t commerciële fungicide Rizolex-T (remmingspercentage 99,45 ± 0,39%; Figuur 2C) bij de hoegste geteste concentratie (10 mg/L), Figuur 2B, bij de geteste concentratie (10 mg/L). wat ‘n soortgelieke effectiviteit aonguuf.
Figuur 2. In vitro antibacteriële activiteit vaan L-ornithine tege Sclerotinia sclerotiorum. (A) Vergelieking vaan de antibacteriële activiteit vaan versjèllende concentraties vaan L-ornithine tege S. sclerotiorum mèt ‘t commercieel fungicide Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Remmingsnelheid (%) vaan S. sclerotiorum myceliale greuj nao behandeling mit versjèllende concentraties vaan L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) of Rizolex-T (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L), respectievelik. Waardes representere ‘t gemiddelde ± SD vaan vief biologische herhaolinge (n = 5). Versjèllende lètters geve statistische versjille tusse behandelinge aon (p < 0,05). (D, E) Probit-modelregressieanalyse vaan L-ornithine en commercieel fungicide Rizolex-T, respectievelik. De regressielijn vaan ‘t probitmodel weurt getoend es ‘n vaste blauwe lijn en ‘t vertrouwesinterval (95%) weurt getoend es ‘n gesjtriep roej lijn.
Daonaeve woort probit-regressie-analyse oetgeveurd en de euvereinkomstege plots zien in Tabel 1 en Figure 2D,E getoende. Kort samegevat, de geaccepteerde hellingswaarde (y = 2,92x − 4,67) en de bijbehurende significante statistieke (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 en p < 0,0001; Figuur 2D) vaan L-ornithine gaove op ‘n verbeterde antisjummelactiviteit tege de commercieel Snell. fungicide Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 en p < 0,0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Waardes vaan de half-maximum remmende concentratie (IC50) en IC99 (mg/l) vaan L-ornithine en commercieel fungicide “Rizolex-T” tege S. sclerotiorum.
Euver ‘t algemein verminderde L-ornithine (250 mg/L) de ontwikkeling en de ernst vaan witte sjummel op behanjelde gewone bonenplante in vergelieking mit onbehandelde mit S. sclerotiorum besmette plante (controle; Figuur 3A). Kort samegevat, hoewel de ernst vaan de krenkde vaan onbehandelde besmette controleplante geleidelek touwnaom (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, en 92,33 ± 3,06%), verminderde L-ornithine de ernst vaan de krenkde (%) significant (%) gedurende ‘t experimint (8,97 ± 1,15, 1,00 ± 1,00, en 1,00 ± 1,00,00 26,36 ± 3,07) op 7, 14 en 21 daag nao de behandeling (dpt), respectievelik (Figuur 3A). Op dezelfde meneer, wie S. sclerotiorum-geïnfecteerde bonenplante woorte behandeld mit 250 mg/L L-ornithine, naom ‘t oppervlak oonder de krenkdeprogressiecurve (AUDPC) aaf vaan 1274,33 ± 33,13 in de neet-behandelde controle nao 281,03 ± 7,95, wat lieger lieger waor es dat vaan de positieve controlecontrole. mg/L Rizolex-T fungicide (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Dezelfde trend woort gezeen in ‘t twiede experimint.
Fig. 3. Effect vaan exogene toepassing vaan L-ornithine op de ontwikkeling vaan witte rot vaan gewone boon veroorzaak door Sclerotinia sclerotiorum oonder broeikascondities. (A) De progressiecurve vaan de krenkde vaan witte sjummel vaan gewone boene nao behandeling mèt 250 mg/L L-ornithine. (B) Oppervlak oonder de krenkdeprogressiecurve (AUDPC) vaan witte sjummel vaan gewone boene nao behandeling mèt L-ornithine. Waardes representere ‘t gemiddelde ± SD vaan vief biologische herhaolinge (n = 5). Versjèllende lètters geve statistisch significante versjille tusse behandelinge aon (p < 0,05).
De exogene toepassing vaan 250 mg/L L-ornithine verhoogde de planthuugde (afb. 4A), ‘t aontal takke per plant (afb. 4B) en ‘t aontal blaajer per plant (afb. 4C) nao 42 daag. Onderwieles dat ‘t commercieel fungicide Rizolex-T (50 mg/L) ‘t groetste effek had op alle bestudeerde voedingsparameters, had exogene toepassing vaan 250 mg/L L-ornithine ‘t twiede groetste effek in vergelieking mit onbehandelde controle (afb. 4A-C). Aan de andere kant had L-ornithine-behandeling gein significant effek op de inhoud vaan fotosynthetische pigmente chlorofyl a (afb. 4D) en chlorofyl b (afb. 4E), mer verhoegde ‘t totale carotenoïdegehalte (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) in vergelieking mit de negatieve controle (0,40 ± 0,03 mg/g fr wt) en positief. controle (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Euver ‘t algemein duide dees resultate aon tot L-ornithine neet fytotoxisch is veur behandelde peulvruchte en zelfs hun greuj kin stimulere.
Fig. 4. Effect vaan exogene L-ornithine-toepassing op greujkenmerke en fotosynthetische pigmente vaan boeneblaajer besmet mit Sclerotinia sclerotiorum oonder broeikascondities. (A) Planthuugde (cm), (B) Aantal takke per plant, (C) Aantal blaajer per plant, (D) Chlorofyl a-gehalte (mg g-1 fr wt), (E) Chlorofyl b-gehalte (mg g-1 fr wt), (F) Totaal carotenoïdegehalte (mg g-1 fr wt). Waardes zien ‘t gemiddelde ± SD vaan vief biologische herhaolinge (n = 5). Versjèllende lètters geve statistisch significante versjille tusse behandelinge aon (p < 0,05).
In situ histochemische lokalisatie vaan reactieve zoersjtofsoorte (ROS; oetgedruk es waterstofperoxide [H2O2]) en vrije radicale (oetgedruk es superoxideanione [O2•−]) onthulde dat exogene toepassing vaan L-ornithine (250 mg/L) de accumulatie vaan H250 (250 mg/L) significant verminderde (250 ± 36 ± . nmol.g−1 FW; Fig. 5A) en O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) in vergelieking mit de accumulatie vaan zoewel onbehandelde besmette plante (173,31 ± 12,06 en 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectievelik mg/L vaan ‘t commercieel fungicide Rizolex-T (170,12 ± 9,50 en 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectievelik) op 72 oor. Hoge niveaus vaan H2O2 en O2•− verzamelde zich oonder hpt (afb. 5A, B). Op dezelfde meneer leet op TCA-gebaseerde malondialdehyde (MDA)-test zien dat S. sclerotiorum-geïnfecteerde bonenplante hoeger niveaus vaan MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) in hun blaajer verzamelde (afb. 5C). De exogene toepassing vaan L-ornithine verminderde de lipideperoxidatie echter significant, wie te zeen is door de aafname vaan ‘t MDA-gehalte in behandelde plante (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effect vaan exogene L-ornithine-toepassing op belangrieke markers vaan oxidatieve stress en neet-enzymatische antioxidant-verdeidigingsmechanismes in boeneblaajer besmet mit S. sclerotiorum 72 oor nao de infectie in broeikascondities. (A) Waterstofperoxide (H2O2; nmol g−1 FW) bij 72 hpt, (B) superoxideanion (O2•−; nmol g−1 FW) bij 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) bij 72 hpt, (D) totale oplosbare fenols (G−1 FW) bij 72 hpt hpt, (E) totale oplosbare flavonoïden (mg RE g−1 FW) bij 72 hpt, (F) totale vrije aminozure (mg g−1 FW) bij 72 hpt, en (G) prolinegehalte (mg g−1 FW) bij 72 hpt. Waardes representere ‘t gemiddelde ± sjtandaardaafwieking (gemiddeld ± SD) vaan 5 biologische herhaolinge (n = 5). Versjèllende lètters geve statistisch significante versjille tusse behandelinge aon (p < 0,05).