Huidig ​​*Huidig ​​adres: Keulen 50931, Duitsland, Keulen Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
De neurodegeneratie vaan mitochondriale krenkdes weurt besjouwd es onherroepbaar umtot de metabolische plasticiteit vaan neurone beperk is, mer ‘t effek vaan mitochondriale dysfunctie op de cellautonomie vaan neuronale metabolisme in ‘t liechaam is slech begrepe. Hei introducere veer ‘t celspecifieke proteoom vaan Purkinje-neurone mit ‘n progressief OXPHOS-deficiëntie veroorzaak door ‘n versjteurde mitochondriale fusiedynamiek. We höbbe gevoonde dat mitochondriale dysfunctie ‘n deepgaonde verandering in ‘t veld vaan de proteomica veroorzaakde, wat oeteindelek leide tot de sequentiële activering vaan perceize metabolische programma’s veur de doed vaan de cel. Onverwachs bepaolde ver de dudelike inductie vaan pyruvaatcarboxylase (PCx) en aandere anti-aging enzyme die de tussemiddele vaan de TCA-cyclus aanvulle. Remming vaan PCx verergerde oxidatieve stress en neurodegeneratie, wat aonguuf dat atherosclerose ‘n besjermend effek heet in neurone die OXPHOS neet höbbe. ‘t Hersjtèlle vaan mitochondriale fusie in terminaal gedegenereerde neurone umkiert dees metabolische kenmerke volledig, en veurkomt zoe de doed vaan cel. Ozze bevindinge identificere nog oonbekinde paajer die weerstand geve aon mitochondriale dysfunctie en laote zien dat neurodegeneratie zelfs in de late stadia vaan de krenkde umgedrejd kin weure.
De centrale rol vaan mitochondria in ‘t behawwe vaan neuronale energiemetabolisme weurt benaodrök door de oetgebreide neurologische symptome die geassocieerd weure mit minseleke mitochondriale krenkdes. De meiste vaan dees krenkdes were veroerzaak door genmutaties die mitochondriale genexpressie regulere (1, 2) of genvernietiging in verband met mitochondriale dynamiek, die indirek de stabiliteit vaan mitochondriale DNA (mtDNA) beïnvleuje (3, 4). Werk in diermodelle heet aongetoond dat es reactie op mitochondriale dysfunctie in umligkend weefsel, conservatieve stofwisselingsweeg (5-7) kinne weure geactiveerd, wat belangrieke informatie lievert veur ‘n deepgaond begrip vaan de pathogenese vaan dees complexe krenkdes. Daoretege is us begrip vaan de metabolische veranderinge vaan specifieke celtypes veroorzaak door ‘t algemein mislukking vaan de productie vaan adenosinetrifosfaat (ATP) in de mitochondriaal herses fundamenteel (8), boebij de behoefte benaodrök um therapeutische doelwitte te identificere die kinne weure gebruuk um krenkdes te veurkoume of te veurkoume. Neurodegeneratie veurkomme (9). ‘t Gebrek aon informatie is ‘t feit dat zenuwcelle in ‘t algemein weure besjouwd es ‘n hiel beperkde metabolische flexibiliteit in vergelieking mit de celtypes vaan ‘t umringende weefsel (10). Aongezeen dees celle ‘n centrale rol speule in ‘t coördinere vaan de veurziening vaan metaboliete aon neurone um synaptische euverdrach te bevordere en te reagere op letsels- en krenkdescondities, is ‘t vermoge um celmetabolisme aon te passe aon de oetdagende umstandeghede vaan herseweefsel bekans beperk tot gliale celle (11-14). Daoneve belemmert de inherènte cellulaire heterogeniteit vaan hersenweefsel de studie vaan metabolische veranderinge die in specifieke neuronale subgróppe plaotsvinde. Daodoor is wieneg bekind euver de exacte cellulaire en metabolische gevolge vaan mitochondriale dysfunctie in neurone.
Um de metabolische gevolge vaan mitochondriale dysfunctie te begriepe, höbbe veer Purkinje-neurone (PN’s) in versjèllende stadia vaan neurodegeneratie veroorzaak door de vernietiging vaan de mitochondriale boetemembraanfusie (Mfn2) geïsoleerd. Alhoewel Mfn2-mutaties in minse geassocieerd zien mit ‘n vörm vaan erfeleke motorische sensorische neuropathie bekind es Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), is de veurwaardelike vernietiging vaan Mfn2 in muis ‘n good erkinde inductie vaan oxidatie-fosforylatie (OXPHOS)-dysfunctiemethode. De versjillende neuronale subtypes (16-19) en ‘t resulterende neurodegeneratieve fenotype gaon gepaard mit progressieve neurologische symptome, wie bewegingsstoornisse (18, 19) of cerebellaire ataxie (16). Door ‘n combinatie vaan label-free kwantitatieve (LFQ) proteomica, metabolomica, beeldvorming en virologische methodes te gebruke, laote veer zien dat progressieve neurodegeneratie pyruvaatcarboxylase (PCx) en aandere factore die betrokke zien in arteriosclerose vaan PN’s in vivo sterk induceert. De expressie vaan enzyme. Um de relevantie vaan dees bevinding te verifiëre, höbbe veer de expressie vaan PCx in Mfn2-deficiënte PN’s specifiek aafgereguleerd, en höbbe veer gevoonde dat dees operatie oxidatieve stress verergerde en neurodegeneratie versnelde, wat bewies dat azoospermie celdoed Metabolische aonpasbaarheid verlient. Ernstige expressie vaan MFN2 kin de terminale degeneratie PN volledeg redde mit ernstige OXPHOS-tekort, massief consumptie vaan mitochondriaal DNA en bliekbaar gebroke mitochondriaal netwerk, wat weijer benaodrök dat deze vörm vaan neurodegeneratie zelfs in ‘t geavanceerde stadium vaan de krenkde kin hersjtèlle veur de celdoed.
Um de mitochondria in Mfn2 knock-out PN’s te visualisere, gebruukde veer ‘n muisstam dee Cre-afhankelike mitochondria in staot stelt um de Cre-expressie vaan gele fluorescerend eiwit (YFP) (mtYFP) (20) te riechte en de mitochondriale morfologie in vivo gecontroleerd. Ver höbbe gevoonde dat de vernietiging vaan ‘t Mfn2-gen in PN’s zouw leije tot de geleideleke verdeiling vaan ‘t mitochondriale netwerk (Figuur S1A), en de ierste verandering woort gevoonde op 3 weke leeftied. Daoretege begos de substantiële degeneratie vaan de PN-cellaog, wie aongetoond door ‘t verluus vaan Calbindin-immunokleuring, pas op 12 weke leeftied (Figuur 1, A en B). De tied mismatch tusse de ierste veranderinge in de mitochondriale morfologie en ‘t zichtbare begin vaan de neuronale doed brach us d’rtoe um de metabolische veranderinge te oonderzeuke die veroerzaak woorte door mitochondriale dysfunctie veur de celdoed. We höbbe ‘n op fluorescentie-geactiveerde celsortere (FACS) gebaseerde strategie oontwikkeld um YFP (YFP+)-expresserende PN te isolere (Figuur 1C), en in controlemuis (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hiernao CT (Figuur S1BRL) geneump. De optimalisatie vaan de gatingstrategie gebaseerd op de relatieve intensiteit vaan ‘t YFP-signaal stelt us in staot um ‘t YFP+-liechaam (YFPhigh) vaan PN’s te zuivere vaan neet-PN’s (YFPneg) (Figuur S1B) of vermeinde fluorescerende axon/dendritische fragminte (YFPlow; Figuur S1D, links), bevesteg door confocaal microscoop (Figuur S1D, rechs). Um de identiteit vaan de geclassificeerde populatie te verifiëre, höbbe veer LFQ-proteomica en vervolgens de hoofcomponente-analyse oetgeveurd, en voonte veer dat d’r ‘n dudelike sjeiing is tusse YFPhigh- en YFPneg-celle (Figuur S1C). YFPhigh-celle toonde ‘n netto verrieking vaan bekinde PNs-markers (d.w.z. Calb1, Pcp2, Grid2 en Itpr3) (21, 22), mer gein verriekking vaan eiwitte die dèks tot expressie komme in neurone of aandere celtypes (Figuur 1D) ). ‘n Vergelieking tösse monsters in geclassificeerde YFPhigh-celle verzameld in onaafhankelike experimente toonde ‘n correlatiecoëffisjent> 0,9, wat ‘n gooje reproduceerbaarheid tusse biologische replica’s aontuent (Figuur S1E). Samevattend, dees data valideerde ós plan veur acuut en specifiek isolatie vaan haolbaar PN. Umtot ‘t gebruukde L7-cre driversysteem in de ierste week nao de geboorte mozaïekrecombinatie induceert (23), begoste we muis vaan CTRL en veurwaardelek (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neurone te verzamele. Naodat de recombinatie is voltooid, weurt ‘t op 4 weke leeftied Mfn2cKO geneump. Es eindpunt koze veer 8 weke aajd es de PN-laog intact waor ondanks de dudelike mitochondriale fragmentatie (Figuur 1B en Figuur S1A). In totaal höbbe we ‘n totaal vaan 3013 eiwitte gekwantificeerd, boevaan oongeveer 22% gebaseerd waore op MitoCarta 2.0-annotaties gebaseerd op ‘t mitochondriale proteoom es mitochondrie (Figuur 1E) (Figuur 1E) (24). De differentiële genexpressieanalyse die in week 8 woort oetgeveurd, leet zien dat mer 10,5% vaan alle eiwitte significante veranderinge hadde (Figuur 1F en Figuur S1F), boevaan 195 eiwitte woorte oondergereguleerd en 120 eiwitte woorte umhoeg gereguleerd (Figuur 1F). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat de “innovatieve weeganalyse” vaan dees gegevensset toont dat de gene die differentieel tot expressie zien veurnaomelek behure tot ‘n beperkte set vaan specifieke metabolische weeg (Figuur 1G). Interessant is dat, hoewel de downregulatie vaan paajer gerelateerd aon OXPHOS en calciumsignalering de inductie vaan mitochondriale dysfunctie in fusie-deficiënte PN’s bevestig, aandere categorieje die veural ‘t aminozuurmetabolisme betreffe significant umhoeg gereguleerd zien, wat in lijn is mèt ‘t metabolisme dat veurkump in mitochondriale PN’s. disfunctie.
(A) Representatieve confocale foto’s vaan cerebellaire secties vaan CTRL- en Mfn2cKO-muis die progressief verlees vaan PN’s (calbindin, gries) toene; kerne woorte tegekleurd mit DAPI. (B) Kwantificering vaan (A) (eenweganalyse vaan variantie, ***P<0,001; n = 4 tot 6 cirkels vaan drei muis). (C) Experimentele werkstroum. (D) Heatmap-verdeiling vaan markers specifiek veur Purkinje (bove) en aandere celtypes (midde). (E) Venn-diagram wat ‘t aontal mitochondriale eiwitte toont dee in de geclassificeerde PN is geïdentificeerd. (F) Vulkaanplot vaan differentieel tot expressie gebrachte eiwitte in Mfn2cKO neurone op 8 weke (significatie cut-off waarde vaan 1,3). (G) De creativiteitspaadanalyse toent de vief meis belangrieke up-regulatie (roed) en down-regulatie (blauw) paads in de Mfn2cKO PN geclassificeerd es 8 weke. ‘t Gemiddelde expressieniveau vaan eder gedetecteerd eiwit weurt getoend. Heatmap vaan grieswaarde: aongepaste P-waarde. ns, neet belangriek.
Proteomische data leet zien dat de eiwitexpressie vaan complexe I, III en IV geleidelek aafnaom. Complexe I, III en IV bevatte allemaol essensjele mtDNA-gecodeerde sub-einhede, onderwieles dat complex II, wat allein nucleaire gecodeerd waor, in principe neet beïnvlood waor (Figuur 2A en Figuur S2A). . In euvereinstemming mit de proteomische resultate, leet immunohistochemie vaan cerebellaire weefselsecties zien dat ‘t MTCO1 (mitochondriale cytochroom C oxidase subeinheid 1) subeenheidniveau vaan complex IV in PN geleidelek aafnaom (Figuur 2B). De mtDNA-gecodeerde sub-eenheid Mtatp8 waor significant verminderd (Figuur S2A), onderwieles dat ‘t steady-state-niveau vaan de nucleaire-gecodeerde ATP-synthase-sub-eenheid onveranderd bleef, wat consistent is mit ‘t bekinde stabiele ATP-synthase-subassembly F1-complex es de mtDNA-expressie stabiel is. De vörming is consistent. Onderbreke (7). Evaluatie vaan ‘t mtDNA-niveau in de gesorteerde Mfn2cKO PN’s door real-time polymerase kettingreactie (qPCR) bevestegde de geleideleke afname vaan ‘t mtDNA-kopieaantal. In vergelieking mit de controlegroep, op 8 weke leeftied, waor slechts oongeveer 20% vaan ‘t mtDNA-niveau behawwe (Figuur 2C). In lijn mit dees resultate woort de confocale microscopiekleuring vaan Mfn2cKO PN’s gebruuk um DNA te detectere, wat ‘t tiedsaafhankelike consumptie vaan mitochondriale nucleotide aonguuf (Figuur 2D). Ver höbbe gevoonde dat allein sommige kandidate die betrokke waore in de aafbraok vaan mitochondriale eiwitte en stressrespons, umhoeg gereguleerd waore, boe-oonder Lonp1, Afg3l2 en Clpx, en OXPHOS-complex-assemblagefactore. D’r woorte gein significante veranderinge in de niveaus vaan eiwitte die betrokke zien bij apoptose gedetecteerd (Figuur S2B). Op dezelfde meneer höbbe veer gevoonde dat de mitochondria en endoplasmatische reticulumkanale die betrokke zien in ‘t transport vaan calcium mer kleine veranderinge höbbe (Figuur S2C). Daoneve heet de evaluatie vaan autofagie-gerelateerde eiwitte gein significante veranderinge gevoonde, wat in lijn is mit de zichtbare inductie vaan autofagosome in vivo woergenome door immunohistochemie en elektronmicroscopie (Figuur S3). De progressieve OXPHOS-dysfunctie in PN’s geit echter gepaard mit dudelike ultrastructurele mitochondriale veranderinge. Mitochondriale clusters kinne weure gezeen in de celliechame en dendritische buim vaan Mfn2cKO PN’s vaan 5 en 8 weke, en de binnenmembraanstructuur heet deepgaonde veranderinge doorgemaak (Figuur S4, A en B). In euvereinstemming mit dees ultrastructurele veranderinge en ‘n significante aafname in mtDNA, leet analyse vaan acute cerebrale cerebellaire snijve mit tetramethylrhodamine methylester (TMRM) zien dat ‘t mitochondriale membraanpotentieel in Mfn2cKO PN’s significant waor aafgenomme (Figuur S4C).
(A) Tiedloupanalyse vaan ‘t expressieniveau vaan ‘t OXPHOS-complex. Bedink allein eiwitte mit P<0,05 nao 8 weke (tweeweg ANOVA). Stippellijn: Gein aanpassing in vergelieking mit CTRL. (B) Links: Un veurbeeld vaan un cerebellaire gedeilte gelabeld mit anti-MTCO1-antiliechaam (sjaolbalk, 20 μm). ‘t Gebeed dat door Purkinje-celliechame weurt bezat is bedèk door gael. Rechts: Kwantificering vaan MTCO1-niveaus (ein-weg-analyse vaan variantie; n = 7 tot 20 celle geanalyseerd vaan drei muis). (C) qPCR-analyse vaan mtDNA-kopiegetal in de gesorteerde PN (ein-weg-analyse vaan variantie; n = 3 tot 7 muis). (D) Links: Un veurbeeld vaan un cerebellaire snijd gelabeld mit un anti-DNA-antiliechaam (sjaolbalk, 20 μm). ‘t Gebeed dat door Purkinje-celliechame weurt bezat is bedèk door gael. Rechts: Kwantificering vaan mtDNA-lesies (ein-weg-analyse vaan variantie; n = 5 tot 9 celle vaan drei muis). (E) ‘n Veurbeeld vaan ‘n acute cerebellaire sectie mit mitoYFP + Purkinje-celle (pijl) in ‘n opname vaan ‘n patch-clamp vaan de ganse cel. (F) Kwantificering vaan de IV-curve. (G) Representatieve opnames vaan depolariserende sjtroum-injectie in CTRL- en Mfn2cKO Purkinje-celle. Toptrace: De ierste pols die AP veroorzaakde. Onderste trace: Maximum AP-frequentie. (H) Kwantificering vaan postsynaptische spontane inputs (sPSP’s). De representatieve opnametrace en de zoomverhouding zien in (I) getoend. Ein-weg-analyse vaan variantie analyseerde n = 5 tot 20 celle vaan drei muis. Gegevens weure oetgedruk es gemiddelde±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Representatieve spore vaan spontane AP opgenome met behulp vaan de geperforeerde patchclampmodus. Toptrace: Maximum AP-frequentie. Onderste trace: zoom vaan ein AP. (K) Kwantificeer de gemiddelde en maximale AP-frequentie volgens (J). Mann-Whitney-test; n = 5 celle woorte geanalyseerd vaan veer muis. Gegevens weure oetgedruk es gemiddelde±SEM; neet belangriek.
Dudelike OXPHOS-sjaoj woort gedetecteerd in de 8-weke-aajd Mfn2cKO PN, wat aonguuf dat de fysiologische functie vaan neurone ernstig abnormaal is. Daorum analyseerde veer de passieve elektrische kenmerke vaan OXPHOS-deficiënte neurone op 4 tot 5 weke en 7 tot 8 weke door vollecel-patchclamp-opnaome in acute cerebellaire snijde oet te veure (Figuur 2E). Onverwachs waore ‘t gemiddelde rustende membraanpotentieel en de invoerweerstand vaan Mfn2cKO-neurone geliek aon de controle, hoewel d’r subtiele versjille tusse de celle waore (Tabel 1). Op dezelfde meneer woorte op 4 tot 5 weke leeftied gein significante veranderinge in de stroum-spanningsrelatie (IV-curve) gevoonde (Figuur 2F). D’r höbbe echter gein Mfn2cKO-neurone vaan 7 tot 8 weke aajd ‘t IV-regime (hyperpolarisatiestap) euverleef, wat aongief dat d’r in dit late stadium ‘n dudelike geveulegheid is veur hyperpolarisatiepotentieel. Daoretege weure in Mfn2cKO-neurone de depolariserende strouminge die repetitief actiepotentieel (AP)-ontlaoje veroorzake good getolereerd, wat aonguuf dat hun algehele ontladingspatrone neet significant versjille vaan die vaan 8-weke-aajd controle-neurone (Tabel 1 en Figuur 2G). Op dezelfde meneer waore de frequentie en amplitude vaan spontane postsynaptische strouminge (sPSC’s) vergeliekbaar mit die vaan de controlegroep, en de frequentie vaan gebäörtenisse naom touw vaan 4 weke tot 5 weke tot 7 weke tot 8 weke mèt ‘n soortgelieke touwnaome (Figuur 2, H en I). De periood vaan synaptische rijping in PN’s (25). Soortgelieke resultate woorte verkrege nao geperforeerde PN-plekke. Dees configuratie veurkomt de meugelike compensatie vaan cellulaire ATP-defecte, wie kin gebäöre bij ‘t opnumme vaan de ganse cel-patchclamp. In ‘t biezoonder woorte ‘t rustende membraanpotentieel en de spontane aafvuurfrequentie vaan Mfn2cKO-neurone neet beïnvlood (Figuur 2, J en K). Samevattend, dees resultate wieze op dat PN’s mit dudelike OXPHOS-dysfunctie good kinne umgoon mit hoegfrequente ontsjlaagpatrone, wat aonguuf dat d’r un compensatiemechanisme is dat ze in staot stelt um bekans-normale elektrofysiologische reacties te handhave.
Gegevens were oetgedruk es gemiddelde ± SEM (een-weganalyse vaan variantie, Holm-Sidak’s meervoudige vergeliekingstest; *P<0,05). ‘t Einheidsnummer is door hake aongegeve.
We begóste te oonderzeuke of ‘n categorie in de proteomische dataset (Figuur 1G) weeg bevat die ‘n ernstig OXPHOS-tekort kinne tegewerke, en verklaore zoedoende boeveur de aangetaste PN ‘n bekans-normale elektrofysiologie kin behawwe (Figuur 2, E tot K). . Proteomische analyse leet zien dat de enzyme betrokke bij de catabolisme vaan vertakte ketting aminozure (BCAA) significant umhoeg gereguleerd waore (Figuur 3A en Figuur S5A), en dat ‘t eindproduk acetyl-CoA (CoA) of succinyl CoA de tricarboxylate in de arteriosclerosis Acid (TCA)cyclus kin aanvölle. Ver höbbe gevoonde dat de inhoud vaan BCAA transaminase 1 (BCAT1) en BCAT2 allebei touwnaom. Ze katalysere de ierste stap vaan BCAA-catabolisme door glutamaat te generere vaan α-ketoglutaraat (26). Alle sub-einhede die ‘t vertakte ketting keto-zoerdehydrogenase (BCKD)-complex vörme, zien umhoeg gereguleerd (‘t complex katalyseert de dao-op volgende en onomkeerbare decarboxylatie vaan ‘t resulterende BCAA-koolstofskelet) (Figuur 3A en Figuur S5A). D’r woorte echter gein dudelike veranderinge in BCAA zelf gevoonde in de gesorteerde PN, wat kin te wiete zien aon de touwgenome cellulaire opname vaan dees essentiële aminozure of ‘t gebruuk vaan aandere bronne (glucose of melkzuur) um de TCA-cyclus aon te völle (Figuur S5B). PN’s mit OXPHOS toonde ouch verhoogde glutamine-ontbinding en transaminatieactiviteite op 8 weke leeftied, wat kin weure weerspiegeld door de up-regulatie vaan de mitochondriale enzyme glutaminase (GLS) en glutamine pyruvaat transaminase 2 (GPT2) (Figuur 3, A en C). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat de up-regulatie vaan GLS beperk is tot de gesplitsde isoform glutaminase C (GLS-GAC) (de verandering vaan Mfn2cKO/CTRL is ongeveer 4,5-voudig, P = 0,05), en de specifieke up-regulatie in kaankerweefsel kin mitochondriale bioenergie ondersteune. (27).
(A) De wermtekaart toent de vouwverandering in ‘t eiwitniveau veur de gespecificeerde route nao 8 weke. (B) Veurbeeld vaan ‘n cerebellaire snijd gelabeld mit anti-PCx-antiliechaam (sjaolbalk, 20 μm). De gaele pijl wies nao ‘t liechaam vaan de Purkinje-cel. (C) Eiwitexpressieanalyse vaan de tiedverloop geïdentificeerd es ‘n belangrieke kandidaat veur atherosclerose (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 muis). (D) Bove: ‘n Sjematisch diagram dat de versjillende maniere toent um de gelabelde koolstof in de [1-13C]pyruvaattracer binne te gaon (d.w.z. via PDH of trans-arteriële route). Oonder: De vioolgrafiek toent ‘t percentaasj vaan eingelabelde koolstof (M1) umgezat in aspartienzoer, citroenzuur en appelzuur nao ‘t labelere vaan acute hersensjnitte mit [1-13C]pyruvaat (gepaarde t-test; ** P <0,01). (E) Oetgebreide tiedsgesjiedenisanalyse vaan ‘t aongegeve pad. Bedink allein eiwitte mit P<0,05 nao 8 weke. Gestreepte lijn: gein aanpassingswaarde (twie-weeganalyse vaan variantie; * P <0,05; *** P <0,001). Gegeives weure oetgedruk es gemiddelde±SEM.
In ós analyse is BCAA-catabolisme ein vaan de belangriekste up-reguleringsweeg gewore. Dit feit suggereert sterk dat ‘t ventilatievolume dat de TCA-cyclus binnedringk kin weure veranderd in PN mit OXPHOS. Dit kin ‘n belangrieke vörm vaan neuronale metabolische herbedrading zien, wat ‘n directe invlood kin höbbe op de neuronale fysiologie en euverleving tijdens ‘t behawwe vaan ‘n ernstige OXPHOS-dysfunctie. In euvereinstemming mit dees hypothese, höbbe veer gevoonde dat ‘t belangriekste anti-atherosclerotische enzym PCx umhoeg gereguleerd is (Mfn2cKO/CTRL verandert ongeveer 1,5 kier; Figuur 3A), wat de umzètting vaan pyruvaat nao oxaloacetaat (28) katalyseert, wat vermoedelijk in weefsels te weure oetgedruk. (29, 30). In lijn mit de proteomische resultate leet confocale microscopie zien dat de PCx-expressie specifiek en significant verhoeg waor in OXPHOS-deficiënte PN’s, onderwieles dat de PCx-reactiviteit veural beperk waor tot de naburige Bergmann-gliale celle vaan de controle (Figuur 3B). Um de woergenome upregulatie vaan PCx functioneel te teste, behandelde veer acute cerebellaire snijde mit [1-13C]pyruvaat tracer. Wie pyruvaat woort geoxideerd door pyruvaatdehydrogenase (PDH), verdween zien isotooplabel, mer woort ‘t in de TCA-cyclus tusseprodukte opgenome es pyruvaat woort gemetaboliseerd door vasculaire reacties (Figuur 3D). Ter ondersteuning vaan ós proteomische gegeves, höbbe veer ‘n groet aontal markers vaan dees tracer in ‘t aspartenzoer vaan Mfn2cKO-snijje gezeen, onderwieles citroenzoer en appelzuur ouch ‘n maotig trend hadde, hoewel neet significant (Figuur 3D).
In de dopamine-neurone vaan MitoPark-muis mit mitochondriale dysfunctie veroorzaak door dopamine-neurone die specifiek ‘t mitochondriale transcriptiefactor A-gen (Tfam) vernietige (Figuur S6B), waor PCx-expressie ouch significant umhoeg gereguleerd (31), wat aongief dat acetoonzuur arteriosclerose ‘t optrejje vaan de krenkde weurt gereguleerd tijdens de functie vaan neurone OXPHOS in ‘t lief. ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat ‘t is gevoonde dat unieke enzymes (32-34) die tot expressie kinne weure gebrach in neurone die kinne weure geassocieerd mèt arteriosclerose, significant umhoeg gereguleerd zien in PN’s die OXPHOS neet höbbe, zoewie propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA umzètt propionyl-CoA in propio-CoA-mitocony-A en succic-Acondrial mitochondrial. enzym 3 (ME3), wiens hoofrol is um pyruvaat oet malaat trök te winne (Figuur 3, A en C) (33, 35). Daoneve höbbe veer ‘n significante touwnaome gevoonde in ‘t Pdk3-enzym, wat PDH fosforyleert en dus inactiveert (36), terwijl d’r gein veranderinge woorte gedetecteerd in ‘t Pdp1-enzym dat PDH activeert of ‘t PDH-enzymcomplex zelf (Figuur 3A). Consequent, in Mern2cKO PNs, woort de fosforylatie vaan de α1 subeinheid α (PDHE1α) subeenheid vaan de pyruvaatdehydrogenase E1-component vaan ‘t PDH-complex in Ser293 (bekind um de enzymactiviteit vaan PDH te remme) versterk (Figuur S6C) (Figuur S6C). Pyruvaat heet gein vaattoegang.
Oeteindelik höbbe veer gevoonde dat de superroute vaan serine- en glycinebiosynthese, de gerelateerde mitochondriale folaat (1C) cyclus en prolinebiosynthese (Figuur 1G en Figuur S5C) allemaol volgens rapporte significant umhoeg gereguleerd zien, volgens versjlage, tijdens ‘t activeringsproces. ‘t Umligkende weefsel weurt geactiveerd door mitochondriale dysfunctie (5-7). Confocale analyse die dees proteomische data ondersteunt, leet zien dat in PN mit OXPHOS oontbrekend, cerebellaire snijve vaan 8-week-aajd muis woorte oonderworpe aon serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), ‘n sleutel enzym vaan de mitochondriale folaatcyclus. Significante immuunrespons (Figuur S5D). In 13 CU-glucose-geïncubeerde acute cerebellaire slice bevestige metabolische tracing-experimente de up-regulatie vaan serine- en prolinebiosynthese wijer, wat aonguuf dat de flux vaan koolstof-isoforme in serine- en proline touwnaom (Figuur S5E). Aongezeen de reacties die door GLS en GPT2 weure bevorderd, verantweurdelek zien veur de synthese vaan glutamaat oet glutamine en de transaminasie tusse glutamaat en α-ketoglutaraat, gief hun upregulatie aon tot OXPHOS-deficiënte neurone ‘n verhoegde vraog nao glutamaat höbbe. Dit kin gerich zien op ‘t behawwe vaan de verhoegde biosynthese vaan proline (Figuur S5). In taegesjtelling tot dees veranderinge, leet ‘n proteomische analyse vaan cerebellaire astrocyte vaan PN-specifieke Mfn2cKO-muis zien dat dees paajer (inclusief alle antiperoxidase) neet significant veranderde in expressie, wat aontoent dat dees metabolische umleiding selèctief is veur aafgebraoke PN (afb. S6, D tot G).
Samevattend, dees analyses onthulde significant versjillende patroene vaan tijdeleke activering vaan specifieke stofwisselingsweeg in PN’s. Alhoewel abnormale neuronale mitochondriale functie kin leie tot vreuge atherosclerose en 1C-hermodellering (Figuur 3E en Figuur S5C), en zelfs veurspelbare veranderinge in de expressie vaan I- en IV-complexe, zien de veranderinge in serine de novo-synthese allein in de late stadia. OXPHOS-dysfunctie (Figuur 3E en Figuur S5C). Dees bevindinge definiëre un sequentieel perces boe-in de door stress geïnduceerde mitochondriale (1C-cyclus) en cytoplasmatische (serinebiosynthese) reactie synergisch reagere mit de touwnaome vaan atherosclerose in de TCA-cyclus um de neuronale metabolisme te hervörme.
8-week-aajd OXPHOS-deficiënte PN’s kinne hoegfrequente excitatieactiviteit behawwe en significante metabolische herconnectie oondergoon um mitochondriale dysfunctie te compenseren. Dees oontdèkking bringk ‘n interessante meugelikheid op dat zelfs op dit momint dees celle ouch therapeutische interventie kinne kriege um neurodegeneratie te vertrage of te veurkoume. Laat. Ver höbbe dees meugelikheid opgelos door middel vaan twie oonaofhenkeleke interventies. In de ierste methode höbbe veer ‘n Cre-afhankelike adeno-geassocieerd virus (AAV) vector ontworpe, zoetot MFN2 selèctief kin weure oetgedruk in OXPHOS-deficiënte PN’s in vivo (Figuur S7A). De AAV die MFN2 codeert en ‘t fluorescerend reportergen mCherry (Mfn2-AAV) woorte gecontroleerd in primaire neuronkweek in vitro, wat veroorzaakde dat MFN2 op ‘n Cre-aofhenkeleke meneer tot expressie woort gebrach en de mitochondriale morfologie heet gered, boedoor neuromutatie in Mfn2cKO-neurone woort veurkomme (Figuur S7, B en B). Vervolgens voerde we in vivo experimente oet um 8-week-aajd Mfn2-AAV stereotactisch te levere aon de cerebellaire cortex vaan Mfn2cKO en controlemuis, en analyseerde we 12-week-aajd muis (Figuur 4A). De behandelde Mfn2cKO-muis steerve (Figuur 1, A en B) (16). Virale transductie in vivo resulteerde in selèctieve expressie vaan PN in sommige cerebellaire cirkels (Figuur S7, G en H). De injectie vaan de controle-AAV dee allein mCherry (Ctrl-AAV) expresseerde, had gein significant effek op de maote vaan neurodegeneratie in Mfn2cKO-bieste. Daoretege leet de analyse vaan Mfn2cKO’s getransduceerd mit Mfn2-AAV ‘n significant besjermend effek zien vaan de PN-cellaog (Figuur 4, B en C). In ‘t bezunder liek de neurondichtheid bekans neet te ondersjeie vaan de controlebieste (Figuur 4, B en C, en Figuur S7, H en I). De expressie vaan MFN1 mer neet MFN2 is eve effectief in ‘t redde vaan neuronale doed (Figuur 4C en Figuur S7, C en F), wat aonguuf dat de expressie vaan ectopisch MFN1 ‘t gebrek aon MFN2 effectief kin aanvölle. Wiejere analyse op ‘t enkele PN-niveau leet zien dat Mfn2-AAV de ultrastructuur vaan mitochondrie groetendeils redde, mtDNA-niveaus normaliseerde en de hoege expressie vaan de anti-angiogenese-marker PCx ​​umkierde (Figuur 4, C tot E). Visueel inspectie vaan de gered Mfn2cKO-muis in ‘n russtaot leet zien dat hun houding en motorische symptome (beweging S1 tot S3) verbeterd waore. Concluderend laote dees experimente zien dat vertraogde herintroductie vaan MFN2 in PN’s die ernstig tekort aon OXPHOS voldoende is um mtDNA-consumptie um te keer te bringe en atherosclerose te veroorzake, en zoedoende axondegeneratie en neuronale doed in vivo te veurkoume.
(A) ‘n Sjema wat ‘t experimentele schema toent veur ‘t injectere vaan AAV dee MFN2 codeert es de aongegeve metabolische weeg geactiveerd weurt. (B) Representatieve confocaal beelde vaan 12-week-aajd cerebellaire snijve die nao 8 weke in Mfn2cKO-muize woorte getransduceerd en gelabeld mit anti-Calbindin-antiliechaam. Rechts: Sjaoling vaan axonvezels. De sjaol vaan de axonzoom is 450 en 75 μm. (C) Links: Kwantificering vaan de Purkinje-celdichtheid in de AAV-transductielus (AAV+) (ein-weg-analyse vaan variantie; n = 3 muis). Rechts: mtDNA-focusanalyse in getransduceerde PN in week 12 (ongepairde t-test; n = 6 celle vaan drei muis). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Representatieve transmissie-elektronmicrofoto’s vaan PN’s vaan Mfn2cKO cerebellaire secties getransduceerd mit de aongegeve virale vectore. ‘t Roze masker illustreert ‘t oppervlak dat door dendriete weurt bezat, en ‘t gael gepunte veerkant illustreert de zoom die aon de rechterkant is gegeve; n steit veur de kern. Sjaolbalk, 1μm. (E) toent un veurbeeld vaan PCx-kleuring in PN getransduceerd nao 12 weke. Sjaolbalk, 20μm. OE, euverexpressie; FC, vouwwisseling.
Oeteindelik höbbe we ‘t belang vaan de door peroxidase geïnduceerde celleuverleving in PN’s die OXPHOS-dysfunctie höbbe ervare, oonderzeuk. Ver höbbe mCherry gegenereerd dat AAV-shRNA (kort haarspeld-RNA) codeert, specifiek geriech op muis PCx mRNA (AAV-shPCx), en höbbe ‘t virus of zien gecombineerde controle (AAV-scr) in de cerebellum vaan Mfn2cKO muize geïnjecteerd. De injectie woort oetgeveurd in de veerde week vaan leeftied (Figuur 5A) um effectieve PCx-knockdown te bereike in de periood boe de PCx-expressie touwnaom (Figuur 3C) en de PN-cellaog nog intact waor (Figuur 1A). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat ‘t aafbreke vaan PCx (Figuur S8A) leidt tot ‘n significante versnelling vaan de PN-doed, dee beperk is tot de besmette ring (Figuur 5, B en C). Um ‘t mechanisme vaan de metabolische effecte te begriepe die door PCx-up-regulatie woorte veroorzaak, bestudeerde veer de redoxstatus vaan PN’s naodat PCx-knockdown en AAV-gemedieerde optische biosensor Grx1-roGFP2 tegeliekertied woorte oetgedruk (Figuur S8, B tot D) um glutathion De relatieve verandering vaan ‘t redoxpeptidepotentieel te evaluere (838). Daonao höbbe we twie-foton fluorescentie lifetime imaging microscopy (FLIM) oetgeveurd in acute hersesnijje vaan 7-week-aajd Mfn2cKO of controle-nèsgenoete um potentiële veranderinge in cytoplasmatische redoxstatus te detectere nao ‘t verifiëre vaan FLIM-condities (Figuur S8, E tot G). De analyse toonde ‘n significante touwnaome in de oxidatiestaot vaan ein Mfn2cKO PN’s mit PCx-expressie, wat aanders is es controle-neurone of Mfn2cKO PN’s die allein gescrambled shRNA expressere (Figuur 5, D en E). Wie de PCx-expressie aafgereguleerd woort, naom ‘t percentaasj Mfn2cKO PN’s die ‘n hoeg geoxideerde sjtaot toonde mit mie es drie kier touw (Figuur 5E), wat aonguuf dat PCx-op-regulering de redoxcapaciteit vaan degenereerde neurone behawwe.
(A) ‘n Sjema wat ‘t experimentele schema toent veur ‘t injectere vaan AAV dee shPCx codeert es de aongegeve metabolische weeg geactiveerd weurt. (B) Representatieve confocale foto’s vaan 8-week-aajd cerebellaire secties in Mfn2cKO-muis getransduceerd en gelabeld mit anti-calcineurine-antiliechaam nao 4 weke. Sjaolbalk, 450μm. (C) Kwantificering vaan de Purkinje-celdichtheid in AAV-getransduceerde lusse (eenweganalyse vaan variantie; n = 3 tot 4 muis). Gegevens weure oetgedruk es gemiddelde±SEM; ***P<0,001. (D) De representatieve FLIM-afbeelding toent de gemiddelde levesduur vaan 7-weke-aajd PN die glutathion redox-sensor Grx1-roGFP2 expresseert oonder de gespecificeerde experimentele umstandeghede. LUT (opzeuktabel) ratio: euverlevingstiedsinterval (in picoseconde). Sjaolbalk, 25μm. (E) ‘t Histogram toent de verdeiling vaan Grx1-roGFP2 levensduurwaarde vaan (D) (n=158 tot 368 celle in twie muis oonder eder conditie). De cirkeldiagram baove eder histogram: toent ‘t aontal celle mit significant langere (roed, geoxideerd) of kortere (blauw, verminderde) levesduurwaarde, die 1 SD vaan de gemiddelde levesduurwaarde in CTRL-AAV-scr euvertreffe. (F) ‘t Veurgesjtèlde model toent ‘t besjermende effect vaan upregulering vaan neuronale PCx.
Al met al toene de data die we hei versjaffe dat de herexpressie vaan MFN2 geavanceerde PN volledig kin redde mit ernstige OXPHOS-tekort, ernstige mtDNA-oetputting en extreem abnormale ista-achtige morfologie, en zodoende zelfs in geavanceerde krenkdes continue veuroetgaank kin beeje. Neurodegeneratie lievert umkeerbaar bewies op vaan ‘t stadium veur de doed vaan de cel. Dees maote vaan metabolische flexibiliteit weurt wiejer benaodrök door ‘t vermoge vaan neurone um atherosclerose (‘n herbedrading vaan de TCA-cyclus) te inducere, wat de PCx-expressie in PN’s mit OXPHOS neet remt en de celdoed verbetert, en zoedoende ‘n besjermende rol speelt (Figuur 5F).
In dit oonderzeuk höbbe veer bewies geleverd dat de reactie vaan PN’s op OXPHOS-dysfunctie geleidelek convergeert nao TCA-cyclus atherosclerose via de differentiële activeringsweeg geactiveerd door metabolische programma’s. Ver bevestegde de proteomische analyse mit väöl complementaire methodes en onthulde dat, es ze weure oetgedaag door ernstige mitochondriale dysfunctie, neurone ‘n nog oonbekinde vörm vaan metabolische elasticiteit höbbe. Tot ós verbazing markeert ut ganse herbedradingsproces neet noedzakelek de terminale stofwisseling die geleidelik en onomkeerbaar mit neurodegeneratie vergezelt, mer ós data suggerere dat ut un onderhawwingsneuroon kin vörme, zelfs in ut stadium veur de celdoed Functioneel compensatiemechanisme. Dees bevinding gief aon tot neurone ‘n aonzeenleke maote vaan metabolische plasticiteit in ‘t lief höbbe. Dit feit bewies dat de latere reïntroductie vaan MFN2 de expressie vaan belangrieke metabolische markers kin umkiere en PN-degeneratie kin veurkoume. In taegesjtelling, ut remt atherosclerose en versnelt zenuwen. transseksueel.
Ein vaan de meis fascinerende bevindinge in ós oonderzeuk is dat PN’s mit gein OXPHOS de TCA-cyclusmetabolisme kinne aanpasse door enzyme die specifiek arteriosclerose stimulere, op te regulere. Metabolische herrangsjikking is ‘n algemein kenmerk vaan kaankercelle, boevaan sommege aofhenkelek zien vaan glutamine um de TCA-cyclus-tussemiddele aon te völle um reducerende equivalente te producere, die de luchtwegekèttel aonveure en de productie vaan lipide- en nucleotidebiosyntheseprecursore oonderhawwe (39 , 40). ‘n Recente studie leet zien dat in perifere weefsels mit OXPHOS-dysfunctie, de herconnectie vaan glutamine/glutamaat-metabolisme ouch ‘n prominente kinmerk is (5, 41), boebij de richting vaan glutamine-intrej in de TCA-cyclus aafhingk vaan vanwege de ernst vaan OXPHOS-besjaoding (41). ). D’r is echter gein dudelik bewies veur ‘n euvereinkoms vaan neuronale metabolische plasticiteit in ‘t lief en de meugeleke relevantie devaan in de cónteks vaan de krenkde. In ‘n recente in vitro-studie bleek dat primaire corticale neurone glutamaatpoele mobilisere veur neurotransmissie, en zoedoende oxidatief metabolisme en atherosclerose bevordere oonder metabolische stresscondities (42). ‘t Is de moeite weerd um op te merke dat oonder de farmacologische remming vaan ‘t TCA-cyclus-enzym succinaatdehydrogenase, weurt gedach dat pyruvaatcarboxylatie de synthese vaan oxaloacetaat in gekweekte cerebellaire korrelneurone oonderhawwe (34). De fysiologische relevantie vaan dees mechanismes veur herseweefsel (boe men dink dat atherosclerose veurnaomelek beperk is tot astrocyte) heet echter nog steeds ‘n belangrieke fysiologische beteikenis (43). In dit geval toene oze data dat PN’s die door OXPHOS in ‘t liechaam beschadig zien, kinne weure euvergesjakeld nao BCAA-aafbraok en pyruvaatcarboxylatie, die de twie hoofbronne zien vaan aanvulling vaan TCA-pool tussemiddele. Alhoewel de vermeinde bijdrage vaan BCAA-catabolisme aon neuronale energiemetabolisme is veurgestèld, is d’r nog steeds gein bewies veur dees mechanismes in vivo, neve de rol vaan glutamaat en GABA veur neurotransmissie (44). Daorum is ‘t gemekkelik um te speculere dat dysfunctionele PN’s automatisch kinne compensere veur ‘t consumptie vaan TCA-tussemiddele, gedreve door ‘t assimilatieproces door ‘n touwnaome vaan atherosclerose. In ‘t biezoonder kin upregulering vaan PCx nuudig zien um ‘n verhoegde vraog nao aspartienzoer te behawwe, wat weurt gesuggereerd in prolifererende celle mit mitochondriale dysfunctie (45). Ozze metabolomische analyse toonde echter gein significante veranderinge in ‘t steady-state niveau vaan aspartienzoer in Mfn2cKO PN’s (Figuur S6A), wat vermoedelijk ‘t versjillende metabolische gebruuk vaan aspartienzoer tusse prolifererende celle en post-mitotische neurone weerspiegelt. Alhoewel ‘t exacte mechanisme vaan PCx-upregulatie in dysfunctionele neurone in vivo nog moot weure gekarakteriseerd, höbbe veer aongetoend dat dees veurbarige reactie ‘n belangrieke rol sjpeelt in ‘t behawwe vaan de redoxstaot vaan neurone, wat woort aongetoend in FLIM-experimente op cerebellaire snijve. In ‘t biezoonder, ‘t veurkoume vaan PN’s um PCx op te regulere kin leie tot ‘n mie geoxideerde staot en de celdoed versnelle. De activatie vaan BCAA-aafbraok en de carboxylatie vaan pyruvaat zien gein menere um ‘t perifere weefsel vaan mitochondriale dysfunctie te karakterisere (7). Daorum lieke ze ‘n prioriteitskenmerk te zien vaan OXPHOS-deficiënte neurone, zelfs al neet ‘t insigste kenmerk, wat belangriek is veur neurodegeneratie. .
Cerebellaire krenkde is ‘n heterogene soort neurodegeneratieve krenkde die zich miestal manifesteert es ataxie en dèks PN’s besjadig (46). Dees neuronpopulatie is veural kwetsbaar veur mitochondriale dysfunctie umtot hun selèctieve degeneratie in muis voldoende is um väöl vaan de motorische symptome die minseleke spinocerebellaire ataxie kenmerke, te reproducere (16, 47, 48). Volgens rapporte is un transgeen moesmodel mit un gemuteerd gen geassocieerd mit minseleke spinocerebellaire ataxie en heet mitochondriale dysfunctie (49, 50), wat ‘t belang vaan ‘t bestudere vaan de gevolge vaan OXPHOS-deficiëntie in PNPH benaodrök. Daorum is ‘t veural gesjik um dees unieke neuronpopulatie effectief te isolere en te bestudere. Echter, aangezeen PN’s erg geveulege zien veur drök en veur ‘n lieg aondeil vaan de ganse cerebellaire celpopulatie verantwoordelek zien, is veur väöl op omics gebaseerde studies selèctieve sjeiing vaan ze es ganse celle nog altied ‘n oetdagende aspèk. Alhoewel ‘t bekans oonmeugelek is um ‘n absoluut gebrek aon besmetting vaan aander celtypes (veural volwasse weefsels) te bereike, höbbe veer ‘n effectieve dissociatiestap gecombineerd mèt FACS um ‘n voldoende aontal levensvatbare neurone veur downstream proteomische analyse te kriege, en höbbe veer ‘n vrij hoege eiwitdekking (ongeveer 3000 eiwitte) in vergelieking mèt de besjtaonde gegevensset vaan de ganse cerebel (15). Door de levensvatbaarheid vaan ganse celle te behawwe, stelt de methode die we hei beeje us neet allein in staot um de veranderinge in de metabolische paajer in de mitochondrie te controlere, mer ouch de veranderinge in de cytoplasmatische tegehangers te controlere, wat ‘t gebruuk vaan mitochondriale membraantags um celtype te verrieke aanvölt. De methode die we besjrieve is neet allein gerelateerd aon de studie vaan Purkinje-celle, mer kin gemekkelik weure touwgepas op eder type cel um metabolische veranderinge in zieke herses aon te pakke, inclusief aander modelle vaan mitochondriale dysfunctie.
Oeteindelik höbbe veer ‘n therapeutisch ventier geïdentificeerd tijdens dit metabolische herrangsjikkingsproces dat de belangriekste teikes vaan cellulaire stress volledeg kin umkiere en neuronale degeneratie kin veurkoume. Daorum kin ‘t begriepe vaan de functionele implicaties vaan de hei besjreve herbedrading fundamentele inziechte geve in meugeleke behandelinge veur ‘t behawwe vaan neuronale levensvatbaarheid tijdens mitochondriale dysfunctie. Toekomstig oonderzeuk gerich op ‘t ontlede vaan veranderinge in energiemetabolisme in aander hersenceltypes is nudeg um de toepasbaarheid vaan dit principe op aandere neurologische krenkdes volledeg te onthulle.
MitoPark-muis zien eerder besjreve (31). C57BL/6N-muis mit loxP-flankerende Mfn2-gene zien eerder besjreve (18) en gekruus mit L7-Cre-muis (23). De resulterende dubbele heterozygote naokoumelinge woorte vervolgens gekruus mit homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP muis um Purkinje-specifieke genknockouts veur Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) te generere. In un subset vaan paring woort ut Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allele (stop-mtYFP) geïntroduceerd via extra kruusing (20). Alle deerprocedures woorte oetgeveurd in euvereinstumming mit Europese, nationale en institutionele riechlijne en woorte goodgekäörd door LandesamtfürNatur vaan Umwelt en Verbraucherschutz, Noord-Rijn-Westfalen, Duitsland. Biestewerk volg ouch de riechlijne vaan de Europese Federatie vaan Laboratoriumbiesteweitesjappevereniginge.
Nao ‘t verdoof vaan de cervicale verlocatie vaan de zwangere vrouw, weurt ‘t moes-embryo geïsoleerd (E13). De cortex woort geonderscheid in Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) aongevöld mit 10 mM Hepes en woort doorgegeve door Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium mit papaïne (20 U/ml) en cysteïne (1μg/ml). Incubeer ‘t weefsel in DMEM) en dissocieer ‘t door enzymatische spijsvertering. Ml) bij 37°C veur 20 minute, en vervolgens mechanisch gefrees in DMEM aongevöld mit 10% foetale runderserum. Celle woorte gezaoje op glaze bedèksels gecoat mit polylysine mit ‘n dichtheid vaan 2×106 per 6 cm kweekschotel of mit ‘n dichtheid vaan 0,5×105 celle/cm2 veur beeldnemingsanalyse. Nao 4 oor woort ‘t medium vervange door Neurobasal serumvrije medium mit 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax. De neurone woorte vervolgens gedurende ‘t ganse experimint bij 37°C en 5% CO2 gehandhaaf en einmaol per week gevoed. Um recombinatie in vitro te kinne inducere, woort 3μl (24-puts kweekplaat) of 0,5μl (24-putsplaat) vaan de volgende AAV9-virusvector gebruuk um neurone op de twiede daag in vitro te behandele: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catalogusnummer 105530-AAV9) en AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catalogusnummer 105545-AAV9).
Muis Mfn1 en Mfn2 complementair DNA (verkriege vaan Addgene plasmide #23212 en #23213, respectievelik) zien gemarkeerd mèt de V5-sequentie (GKPIPNPLLGLDST) aon de C-terminus, en zien samegesmolte mèt mCherry in frame via de T2A-sequentie. Grx1-roGFP2 is un kado vaan Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Door de tdTomato-cassette te vervange mit behölp vaan convensjonele kloonmethodes, woort de cassette in de pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-ruggegraat (Addgene-referentienummer 28306) gesubkloond um pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAV-G-CAG te generere FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 en pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectore. ‘n Soortgelieke strategie woort gebruuk um de controlevector pAAV-CAG-FLEX-mCherry te generere. Um ut AAV-shPCx-construct te generere, is un plasmide AAV-vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) nuudig, dee de DNA-sequentie bevat dee de shRNA-riech op de moes PCx codeert (5′CTTTCGCTACCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGGACTTAGACTAGCTAGACTA 3′) Onder de controle vaan de U6-promotor weurt mCherry gebruuk oonder de controle vaan de CMV-promotor. De productie vaan hulp AAV-vectore woort oetgeveurd volgens de instructies vaan de fabrikant (Cell Biolabs). Kort samegevat, gebruuk un transferplasmide dat mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) veurbiegend Transfectie vaan 29AV-MFN2-V5-T2A-V5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) of Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) coderend gen, zoewie coderend AAV1-capside-eiwit en accessoire-eiwit Packaging-plasmideplasmide, met behulp vaan de calciumfosfaatmethode. ‘t Ruwe virussupernatant woort verkriege door vruus-ontdooicyclusse in ‘n druug ies/ethanolbad en gelyseerde celle in fosfaatgebufferde zoutvloeistof (PBS). De AAV-vector woort gezuuverd door discontinue iodixanolgradiënt ultracentrifugatie (24 oor bij 32.000 rpm en 4°C) en geconcentreerd met behulp vaan un Amicon ultra-15 centrifugaal filter. Genoomtiter vaan AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genoomkopie (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX waor zoe wie eerder besjreve (45), kwantitatief gemaete door PCR-PCR -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) en AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primaire neurone woorte aafgeskraop in ieskawwe 1x PBS, gepelleteerd en vervolgens gehomogeniseerd in 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriumdeoxycholaat/PBS lysebuffer mit fosfatase en proteaseremmer (Roche). De kwantificatie vaan eiwitte woort oetgeveurd door de bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific) te gebruke. De eiwitte woorte vervolgens gesjeije door SDS-polyacrylamidegel-elektroforese en vervolgens op un polyvinylideenfluoride-membraan (GE Healthcare) geblot. Blokkeer neet-specifieke locaties en incubeer mit ‘t primair antiliechaam (zuug Tabel S1 veur details) in 5% milk in TBST (Tris-gebufferde zoutvloeistof mit Tween), wasstappe en secundair antiliechaam in TBST Incubeer. Incubeer mit primair antiliechaam euvernach bij +4°C. Nao ‘t wasse, breng ‘t secundair antiliechaam 2 oor bij kamertemperatuur aan. Vervolgens, door dezelfde blot te incubere mit un anti-β-actine-antiliechaam, woort dezelfde lading bevesteg. Detectie door umzètting nao chemiluminescentie en chemiluminescentie te verbetere (GE Healthcare).
De neurone die eerder op glaze coverslips woorte gezaoje, woorte 10 minute lang bij kamertemperatuur op ‘t bepaolde tiedspunt bij kamertemperatuur gefixeerd mit 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS. De coverslips were iers gepermeeerd mit 0,1% Triton X-100/PBS veur 5 minute bij kamertemperatuur, en daonao in ‘n blokkeerbuffer [3% bovine serum albumine (BSA)/PBS]. Op de twiede daag woorte de coverslips gewasse mit ‘n blokkeerbuffer en geïncubeerd mit ‘t gesjikte fluorofoor-geconjugeerde secundair antiliechaam gedurende 2 oor bij kamertemperatuur; ten slotte woorte de monsters gróndeg gewasse in PBS mit 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) wat woort tegekleurd en vervolgens op de microscoopslide vasgesjtèld mit Aqua-Poly/Mount.
Muis (mannelik en vrouwelik) woorte geanesthetiseerd door intraperitoneale injectie vaan ketamine (130 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) en subcutaan toegediend mit carprofeenpijnstiller (5 mg/kg) , en in un stereotactisch instrumint (Kopf) oetgerös mit un wermpak. Zet de sjedel bloot en gebruuk ‘n tandheelkundige boor um ‘t deil vaan de cerebellaire cortex dat euvereinkeump mit ‘t miskneuk (vaan lambda: sjtart 1,8, ziewaarts 1, euvereinkómmend mit lobules IV en V) te verdunne. Gebruik ‘n gebaoge spuitnaold um veurzichtig ‘n klein gaatje in de sjedel te make um te veurkomme dat de vasculatuur oonder weurt versjteurd. Daonao weurt de dunne getrokken glaze kapillair langzaam in ‘t microgat gestoke (vaan -1,3 tot -1 op de ventrale kant vaan de dura mater), en weurt 200 tot 300 nl AAV in de micro-injector (Narishige) geïnjecteerd mèt handspuits (Narishige) mierdere kiere op ‘n lieg drök euver ‘n periode vaan 10 tot 20 minute. Nao de infusie, plaats de capillaire nog 10 minute um ‘t virus zich gans te laote verspreie. Naodat de capillaire zien trökgetrokke, weurt de huid veurzichteg genaojd um wondontsteking te minimalisere en ‘t bies te laote hersjtelle. De bieste woorte ‘n paar daag nao de operatie behandeld mit pijnstillers (caspofen), gedurende welke tied hun lichamelike touwstand zorgvuldig woort gecontroleerd en daonao woorte ze op ‘t aongegeve tiedspunt geëuthanaseerd. Alle procedures woorte oetgeveurd in euvereinstumming mit Europese, nationale en institutionele riechlijne en woorte goodgekäörd door LandesamtfürNatur vaan Umwelt en Verbraucherschutz, Noord-Rijn-Westfalen, Duitsland.
De bieste woorte geanestetiseerd mit ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en ‘t hart woort iers geperfuseerd mit 0,1 M PBS en daonao mit 4% PFA in PBS. ‘t Weefsel woort geonderscheide en euvernach bij 4°C in 4% PFA/PBS gefixeerd. ‘n Vibrerend mets (Leica Microsystems GmbH, Wien, Oostenriek) woort gebruuk um sagittale secties (50 μm dik) vaan de vaste herses in PBS veur te bereide. Tenzij anders vermeld, woort ‘t kleure vaan vrij zwevende secties oetgeveurd wie heibove besjreve (13) bij kamertemperatuur en door te roere. Kort samegevat, iers woorte de verkrege sjeije permeabiliseerd mit 0,5% Triton X-100/PBS veur 15 minute bij kamertemperatuur; veur sommige epitope (Pcx en Shmt2), door in ‘n tris-EDTA-buffer bij 80°C (PH 9) de sjeije 25 minute te verhitte in plaats vaan dees stap. Vervolgens woorte de secties geïncubeerd mit primair antiliechaam (zuug Tabel S1) in blokkeerbuffer (3% BSA/PBS) bij 4°C euvernach mit roering. De volgende daag woorte de secties gewasse mit ‘n blokkeerbuffer en geïncubeerd mit ‘t gesjikde fluorofoor-geconjugeerde secundair antiliechaam gedurende 2 oor bij kamertemperatuur; ten slotte woorte de secties grondig in PBS gewasse, tegegekleurd mit DAPI en vervolgens vasgesjtèld mit AquaPolymount op un microscoopdia.
‘n Laserscannende confocale microscoop (TCS SP8-X of TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) oetgerös mit ‘n witte leechlaser en ‘n 405-diode ultraviolette laser woort gebruuk um ‘t monster aaf te beelde. Door de fluorofoor te excitere en ‘t signaal te verzamele mit de Hybride Detector (HyD’s), woort LAS-X-software gebruuk um gestapelde beelde te verzamele die voldoon aon Nyquist-sampling in sequentiële modus: veur neet-kwantitatieve panels zien ‘t hoeg dynamische signale (beveurbeeld in somatische celle en dendrite) mtYFPD um ‘t Hybrid Detector te detectere modus). ‘n Gating vaan 0,3 tot 6 ns weurt touwgepas um de achtergroond te vermindere.
Real-time aafbeeldinge vaan gesorteerde celle. Nao ‘t sortere in Neurobasal-A-medium mit 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax, woorte celle onmiddellik op poly-l-lysine-gecoate glaasplate (μ-Slide8 Wel, Ibidi, catalogusnummer 80826) gezaoje, en ‘t vervolgens bij 37°C en 12% CO gehawwe tot de cel ‘n oer laot neersjloon. Real-time beeldvorming woort oetgeveurd op ‘n Leica SP8 laserscannende confocale microscoop oetgerust mit ‘n witte laser, HyD, 63×[1,4 numerieke aperture (NA)] olieobjectieflens en ‘n verhittingspodium.
De moes woort snel geanesthetiseerd mit koolstofdioxide en onthoof, de herses woorte snel oet de sjedel eweggehaold en in ‘n 200 μm dikke (veur ‘t 13C-label-experiment) of 275 μm dikke (veur twie foton-experimente) sagittaal gedeilte gevöld mit de volgende materiale gesjneje. Walldorf, Duitsland) is gevöld mit de volgende stoffe: 125 mM ieskawwe, koolstofverzaodeg (95% O2 en 5% CO2) lieg Ca2 + kunsmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, m2 mM CO2, mM gluse 0,5 mM CaCl2 en 3,5 mM MgCl2 (osmotische drök vaan 310 tot 330 mmol). Verplaats de verkregen hersensjnitte euver nao un pre-incubatiekamer mit hoeger Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 10 mM Ca2 en 20 mM Ca2. MgCl2) Medium) pH 7,4 en 310 tot 320 mmol).
Tijdens ut beeldvormingsproces woorte de sjeije nao un specifieke beeldvormingskamer verplaats, en ut experimint woort oetgeveurd oonder continue ACSF-perfusie bij un constante temperatuur vaan 32° tot 33°C. ‘n Multifoton laser scanmicroscoop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) oetgerös mit ‘n Leica 25x objectief (NA 0,95, water), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) woort gebruuk veur snijbeelde. FLIM-module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM vaan Grx1-roGFP2. De veranderinge in de cytoplasmatische redoxstaot vaan PN’s woorte gemaete door twie-foton FLIM in sagittale hersensjnitte, boe de Grx1-roGFP2-biosensor PN’s riechde. In de PN-laog weurt ‘t opnameveld ongeveer 50 tot 80 μm oonder ‘t snijsoppervlak geselecteerd um te verzekere dat d’r ‘n levensvatbaar PN is (dat wil zègke ‘t gebrek aon kraolestructuur of neuronale morfologische veranderinge langs de dendriete) en de dubbele positieve roGFP2-sensor en AAV die shRNA PCx of zien volgorde codere (controleert alle mC-expressie). Verzamel single-stack aafbeeldinge mit 2x digitale zoom [excitatiegolflengte: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Detectie: interne HyD, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) filtergroep] en beeldgemiddelde binne 2 tot 3 minute weure gebruuk um te verzekere dat genog fotone weure verzameld (1000 fotone in totaal) veur curvepasse. De geveulegheid vaan de Grx1-roGFP2-probe en de verificatie vaan FLIM-condities woorte oetgeveurd door de levensduurwaarde vaan roGFP2 te monitore bij ‘t toevoege vaan exogene 10 mM H2O2 aon de perfusie ACSF (um de oxidatie te maximalisere, wat resulteert in ‘n verhoegde levensduur), en vervolgens ‘t toevoege vaan 2 mM dithiothreit (mit resulteerde in ‘n vermindering vaan de maote vaan vermindering aafname in de levesduur) (Figuur S8, D tot G). Gebruik FLIMfit 5.1.1-software um de verworve resultate te analysere, pas de enkele exponentiële vervalcurve vaan ‘t ganse beeld aon de gemete IRF (instrumentresponsfunctie), en χ2 is ongeveer 1. Um de levensduur vaan ‘n enkele PN te berekene, woort ‘t masker roond ‘t zenuwliechaam met de hand geteikend en woort ‘n gemiddelde levensduur veur eder masker gebruuk.
Mitochondriale potentieel analyse. Naodat de acute sectie woort geïncubeerd mit 100 nM TMRM die direk aon ‘t geperfuseerde ACSF gedurende 30 minute woort toegeveug, woorte de mitochondriale potentieelveranderinge vaan PN’s gemete mit ‘n twie-fotonmicroscoop. TMRM-beeldvorming woort oetgeveurd door de probe op 920 nm te excitere en interne HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) te gebruke um signale te verzamele; door dezelfde excitatiegolflengte te gebruke mer ‘n aandere interne HyD (FITC :525/50) te gebruke um mtYFP te beelde. Gebruik de plug-in vaan ImageJ’s Image Calculator um ‘t mitochondriaal potentieel op ein celniveau te evaluere. Kort samegevat, de plug-in-vergelieking: signal = min (mtYFP, TMRM) weurt gebruuk um ‘t mitochondriale regio te identificere dat ‘t TMRM-signaal in Purkinje Somali toent in ‘t single-stack confocal beeld vaan ‘t euvereinkomstig kanaal. Vervolgens weurt ‘t pixeloppervlak in ‘t resulterende masker gekwantificeerd en vervolgens genormaliseerd op ‘t euvereinkomstig drempel single-stack-beeld vaan ‘t mtYFP-kanaal um de mitochondriale fractie te kriege dee ‘t mitochondriale potentieel toont.
‘t Afbeelding woort gedeconvolueerd mit Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Veur de gescande foto’s vaan tegels weurt de montage vaan ein tegel gemaak mit behulp vaan ‘t automatische stikalgoritme vaan LAS-X-software. Nao de beeldkalibrering, gebruuk ImageJ en Adobe Photoshop um de beeld wijer te verwèrke en de helderheid en ‘t contras uniform aon te passe. Gebruik Adobe Illustrator veur de grafieke veurbereijing.
mtDNA-focusanalyse. ‘t Aontal mtDNA-lesies woort gekwantificeerd op cerebellaire secties die woorte gelabeld mit antiliechame tege DNA door middel vaan confocale microscoop. Eder doelgebeed woort gemaak veur ‘t celliechaam en de kern vaan eder cel, en ‘t respectievelike gebeed woort beraekend met behölp vaan de Multi Measure plug-in (ImageJ-software). Trèk ‘t nucleaire oppervlak aaf vaan ‘t celliechaam oppervlak um ‘t cytoplasmatische oppervlak te kriege. Oeteindelik woort de Analyze Particles-plug-in (ImageJ-software) gebruuk um de cytoplasmatische DNA-punte die mtDNA op ‘t drempelbeeld aongeve automatisch te kwantificere, en de verkrege resultate woorte genormaliseerd op ‘t PN-gemiddelde vaan CTRL-muis. De resultate weure oetgedruk es ‘t gemiddelde aontal nucleoside per cel.
Analyse vaan expressie vaan eiwitte. Gebruik de plug-in vaan ImageJ’s Image Calculator um de expressie vaan eiwit in PN op ein celniveau te evaluere. Kort samegevat, in ‘t confocale beeld vaan ‘t euvereinkomstig kanaal, door de vergelieking: signaal = min (mtYFP, antiliechaam), weurt ‘t mitochondriale gebeed geïdentificeerd dat immunoreaktiviteit toent tege ‘n bepaold antiliechaam in Purkina. Daonao weurt ‘t pixeloppervlak in ‘t resulterende masker gekwantificeerd en vervolgens genormaliseerd op ‘t euvereinkomstig drempel single-stackbeeld vaan ‘t mtYFP-kanaal um de mitochondriale fractie vaan ‘t weergegeve eiwit te kriege.
Purkinje-celdichtheidsanalyse. De Cell Counter-plug-in vaan ImageJ woort gebruuk um de Purkinje-dichtheid te evaluere door ‘t aontal getèlde Purkinje-celle te deile door de lengte vaan de cerebellaire ring dee door de getèlde celle woort bezat.
Veurbereijing en verzameling vaan monsters. De herses vaan de controlegroep en Mfn2cKO-muis woorte gefixeerd in 2% PFA/2,5% glutaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), en vervolgens woorte coronale secties veurbereid met behölp vaan ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Oostenriek) (Dikte 50 tot 60 μm) De fixe in 1% PB buffer tetraoxide en 1,5% kaliumferrocyanide op kamertemperatuur gedurende 1 oor. De secties woorte drei kier gewasse mit gedestilleerd water en vervolgens 20 minute lang gekleurd mit 70% ethanol mit 1% uranylacetaat. De secties woorte vervolgens gedehydreerd in gegradeerde alcohol en in Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxyhars (Electron Microscopy Sciences, catalogusnummer 14040) tusse mit silicium gecoate glaasplate geplaats, en oeteindelik op 60°C gepolymeriseerd in de ove veur 48 oor. ‘t Gebied vaan de cerebellaire cortex woort geselecteerd en 50 nm ultradunne secties woorte op Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Oostenriek) gesneje en op ‘n 2×1 mm kopere gleufrooster gecoat mit polystyreenfilm. De secties woorte gedurende 10 minute gekleurd mit un oplossing vaan 4% uranylacetaat in H2O, mierdere kiere gewasse mit H2O, daonao gedurende 10 minute mit Reynolds-loodcitraat in H2O, en vervolgens mierdere kiere gewasse mit H2O. Microfoto’s woorte gemaak mit ‘n transmissie-elektronmicroscoop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) mit ‘n TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitale camera (TVIPS GmbH, Gauting, VS). Duitsland).
Veur muize die besmet waore mit AAV, woorte ‘t herses gesjeie en in ‘n 1 mm dikke sagittaal gedeilte gesjneje, en ‘t hersen woort oonderzeuk met behölp vaan ‘n fluorescentiemicroscoop um de AAV-besmette ring (dat wil zègke, mCherry-expresserende) te identificere. Allein experimente boe-in AAV-injectie resulteert in ‘n zeer hoege transductie-efficiëntie vaan de Purkinje-cellaog (d.w.z. bekans de ganse laog) in op z’n mins twie opeinvolgende cerebellaire ringe. De door AAV getransduceerde lus woort gemicrodisseceerd veur ‘n nach nao de fixatie (4% PFA en 2,5% glutaraldehyde in 0,1 M cacaatebuffer) en wijer verwerk. Veur EPON-inbedding woort ‘t vaste weefsel gewasse mit 0,1 M natriumkakaobuffer (Applichem) en geïncubeerd mit 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) in 0,1 M natriumkakaobuffer (Applichem) 4 oor, en daan 2 oor gewasse. Herhaol dit 3 keer mit 0,1 M cocamidebuffer. Daonao woort de oploupende reeks ethanol gebruuk um eder ethanoloplossing 15 minute bij 4°C te incubere um ‘t weefsel te dehydrere. ‘t Weefsel woort euvergedrage nao propyleenoxide en euvernach geïncubeerd in EPON (Sigma-Aldrich) bij 4°C. Zet ‘t weefsel 2 oor in verse EPON bij kamertemperatuur en plaats ‘t vervolgens 72 oor op 62°C in. Gebruuk un ultramicrotoom (Leica Microsystems, UC6) en un diamantmets (Diatome, Biel, Zwitserland) um 70 nm ultradunne sjetse te snijje, en kleur 15 minute bij 37°C mit 1,5% uranylacetaat, en kleur 4 minute mit loodcitraatoplossing. De elektronmicrofoto’s woorte gemaak mit ‘n JEM-2100 Plus transmissie elektronmicroscoop (JEOL) oetgerös mit Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) en DigitalMicrograph software (Gatan). Veur de analyse woorte elektronmicrofoto’s gemaak mit 5000× of 10.000× digitale zoom.
Morfologische analyse vaan mitochondria. Veur alle analyses woorte de contoure vaan individuele mitochondria handmatig in digitale aafbeeldinge besjreve mèt behulp vaan ImageJ-software. Versjillende morfologische parameters weure geanalyseerd. Mitochondriale dichtheid weurt oetgedruk es ‘n percentaasj verkriege door ‘t totale mitochondriale oppervlak vaan eder cel te deile door ‘t cytoplasmaoppervlak (cytoplasmaoppervlak = celoppervlak-celkernoppervlak) × 100. De roondheid vaan mitochondrie weurt berekend mit de formule [4π∙(oppervlak/perimeter 2)]. De ista morfologie vaan mitochondria woort geanalyseerd en verdeild in twie cattegorieje (“buis” en “blaas”) volgens hun hoofvörm.
Autofagosoom/lysosom getal en dichtheidsanalyse. Gebruik ImageJ-software um de contoure vaan eder autofagosoom/lysosoom in ‘t digitale aafbeelding handmatig te besjrieve. Autofagosoom/lysosome oppervlak weurt oetgedrök es ‘n percentaasj berekend door ‘t totale autofagosoom/lysosome structuur oppervlak vaan eder cel te deile door ‘t cytoplasma oppervlak (cytoplasma oppervlak=cel oppervlak-kernoppervlak)×100. De dichtheid vaan autofagosome/lysosome weurt beraekend door ‘t totaal aontal te deile door ‘t aontal autofagosoom/lysosome structure per cel (in terme vaan cytoplasmatische oppervlak) (cytoplasmatische oppervlak = cel oppervlak-kernoppervlak).
Etikettering veur acute sectie en steekproefveurbereijing. Veur experimente die glucose-etikettering vereise, bringe de acute hersensnijje euver nao ‘n pre-incubatiekamer, dee verzaodeg koolstof (95% O2 en 5% CO2), hoeg Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 2,5 mM NaCl, 20 mM NaCl, 25 mM, 205 mM bevat. d-glucose, 1,0 mM CaCl 2 en 2,0 mM MgCl 2, aongepas op pH 7,4 en 310 tot 320 mOsm), boe-in glucose 13 C 6- Glucose-vervanging is (Eurisotop, catalogusnummer CLM-1396). Veur experimente die pyruvaat-labelering vereise, bringe de acute hersensnijje euver op ‘n hoeger Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 10 mM Ca2 en Ad. MgCl2, aanpas op pH 7,4 en 310 tot 320mOsm), en voeg 1mM 1-[1-13C]pyruvaat (Eurisotop, catalogusnummer CLM-1082) toe. Incubeer de secties 90 minute bij 37°C. Aan ‘t eind vaan ‘t experimint woorte de secties snel gewasse mit ‘n waterige oplossing (pH 7,4) mit 75 mM ammoniumcarbonaat, en vervolgens gehomogeniseerd in 40:40:20 (v:v:v) acetonitriel (ACN): methanol: water. Naodat de secties 30 minute op ies woorte geïncubeerd, woorte de monsters gecentrifugeerd bij 21.000 g veur 10 minute bij 4°C en woort ‘t heldere supernatant in ‘n SpeedVac-concentrator gedroog. De resulterende gedroogde metabolietpellet woort bewaard bij -80°C tot de analyse.
Vloeistofchromatografie-massaspectrometrieanalyse vaan 13 C-gelabelde aminozure. Veur de analyse vaan vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) woort de metabolietpellet hersuspendeerd in 75μl LC-MS-kwaliteitswater (Honeywell). Nao centrifugatie op 21.000 g veur 5 minute op 4°C, woort 20 μl vaan ‘t verkleurde supernatant gebruuk veur aminozuurfluxanalyse, terwijl de res vaan ‘t extract onmiddellik woort gebruuk veur anionanalyse (zuug heioonder). Aminozuuranalyse woort oetgeveurd met behulp vaan ‘t eerder besjreve benzoylchloridederivatiseringsprotocol (55, 56). In de ierste stap woort 10μl vaan 100 mM natriumcarbonaat (Sigma-Aldrich) touwgevoog aon 20μl vaan metabolietextract, en daonao woort 10μl vaan 2% benzoylchloride (Sigma-Aldrich) touwgevoog aon de LC-kwaliteit ACN. ‘t Monster woort kort gevortexeerd en vervolgens gecentrifugeerd op 21.000 g veur 5 minute op 20°C. Geef ‘t geruimde supernatant euver nao ‘n 2 ml autosamplerflacon mit ‘n conische glaze invoeg (200 μl volume). De monsters woorte geanalyseerd mit behölp vaan ut Acquity iClass ultra-high performance LC-systeem (Waters) verboonde mit de Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). Veur de analyse woort 2μl vaan ‘t gederiveerde monster geïnjecteerd in ‘n 100×1,0 mm hoegsterke silica T3-kolom (Waters) mèt 1,8μm deilkes. De stromingssnelheid is 100μl/min, en ‘t buffersysteem besteit oet buffer A (10 mM ammoniumformaat en 0,15% mierzuur in water) en buffer B (ACN). De gradiënt is wie volg: 0%B op 0 minute; 0%B. 0 tot 15% B op 0 tot 0,1 minute; 15 tot 17% B op 0,1 tot 0,5 minute; B op 17 tot 55% op 0,5 tot 14 minute; B op 55 tot 70% op 14 tot 14,5 minute; op 14,5 tot 70 tot 100% B op 18 minute; 100% B op 18 tot 19 minute; 100 tot 0% B op 19 tot 19,1 minute; 0% B op 19,1 tot 28 minute (55, 56). De QE-HF massaspectrometer functioneert in positieve ionisatiemodus mit un massabereik vaan m/z (massa/laojingsratio) vaan 50 tot 750. De touwgepaste resolutie is 60.000, en ‘t verkrege iondoel (AGC) is 3×106, en de maximale iontied is 10 milconde. De verhitte elektrospray-ionisatie (ESI) bron werkt mit un spuitspanning vaan 3,5 kV, un capillaire temperatuur vaan 250°C, un mantellochstroum vaan 60 AU (wèllekäörege einhede) en un extra lochstroum vaan 20 AU. 250°C. De S-objectief is ingesteld op 60 AU.
Anionchromatografie-MS-analyse vaan 13C-gelabelde organische zure. De euvergebleve metabolietneerslag (55μl) woort geanalyseerd met behölp vaan un Dionex ionchromatografiesysteem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) verboonde mit un QE-HF massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). Kort samegevat, 5μl vaan metabolietextract woort geïnjecteerd in ‘n Dionex IonPac AS11-HC kolom oetgerös mèt HPLC (2 mm×250 mm, deilkesgrootte 4μm, Thermo Fisher Scientific) in push-in partial loop mode mèt ‘n vullingsverhouding vaan 1. ) Dionex IonPac AG11-HC guard kolom ( x 250 mm, 5 mm HC 4μm, Thermo Fisher Scientific). De temperatuur vaan de kolom weurt gehandhaaf op 30°C en de autosampler is ingesjtèld op 6°C. Gebruik un kaliumhydroxidepatroon mit gedeioniseerd water um un kaliumhydroxidegradiënt te generere via de eluentgenerator. Sjeiing vaan metaboliete mit ‘n stromingssnelheid vaan 380μl/min, mit de volgende gradiënt: 0 tot 3 minute, 10 mM KOH; 3 tot 12 minute, 10 tot 50 mM KOH; 12 tot 19 minute, 50 tot 100 mM KOH; 19 tot 21 minute, 100 mM KOH; 21 tot 21,5 minute, 100 tot 10 mM KOH. De kolom woort gedurende 8,5 minute her-equilibreerd oonder 10 mM KOH.
De geëlueerde metaboliete were nao de kolom gecombineerd mit ‘n 150μl/min isopropanolsupplementstroom en vervolgens gestuurd nao ‘n massaspectrometer mit hoege resolutie die in negatieve ionisatiemodus wèrk. MS controleert ‘t massabereik vaan m/z 50 tot 750 mit ‘n resolutie vaan 60.000. De AGC is ingesteld op 1×106, en de maximale iontied is gehawwe op 100 ms. De verhitte ESI-bron woort aangedreve mit un spuitspanning vaan 3,5 kV. De aandere insjtèllinge vaan de ionbron zien de volgende: capillaire temperatuur 275°C; mantelgaasstroum, 60 AU; extra gaasstroum, 20 AU bij 300°C, en S-lens insjtelling op 60 AU.
Gegevensanalyse vaan 13C gelabelde metaboliete. Gebruik TraceFinder-software (versie 4.2, Thermo Fisher Scientific) veur gegevensanalyse vaan isotoopverhouding. De identiteit vaan eder verbinding woort gecontroleerd door ‘n betrokke referentieverbinding en onaafhenkelek geanalyseerd. Um isotoopverriekingsanalyse oet te veure, woort ‘t oppervlak vaan ‘t geëxtraheerde ionchromatogram (XIC) vaan eder 13C-isotoop (Mn) geëxtraheerd oet [M + H] +, boe bei n ‘t koolstofgetal vaan de doelverbinding is, gebruuk um aminozure te analysere of [ MH] + weurt gebruuk um anione te analysere. De massanauwkeurigheid vaan XIC is minder es vief deile per miljoen, en de nauwkeurigheid vaan RT is 0,05 minute. De verriekingsanalyse weurt oetgeveurd door de ratio vaan eder gedetecteerde isotoop te berekene tot de som vaan alle isotope vaan de corresponderende samesjtèlling. Dees rasjo’s were gegeve es percentaasjwaardes veur eder isotoop, en de resultate were oetgedruk es molaire percentaasjverrieking (MPE), zoe wie eerder besjreve (42).
De bevrore neuronpellet woort gehomogeniseerd in ieskawwe 80% methanol (v/v), gevortexeerd en 30 minute bij -20°C geïncubeerd. Vortex ‘t monster weer en roer 30 minute bij +4°C. ‘t Monster woort gecentrifugeerd bij 21.000 g veur 5 minute bij 4°C, en daonao woort ‘t resulterende supernatant verzameld en gedroog mit behölp vaan ‘n SpeedVac-concentrator bij 25°C veur vervolgende analyse. Zoals heibove besjreve, woort LC-MS-analyse oetgeveurd op de aminozure vaan de gesorteerde celle. Mit behulp vaan TraceFinder (versie 4.2, Thermo Fisher Scientific) woort dataanalyse oetgeveurd met behulp vaan de monoisotopische massa vaan eder verbinding. Kwantiele normalisatie vaan metabolietgegevens woort oetgeveurd met behulp vaan ‘t preprocessCore softwarepakket (57).
Snijveurbereijing. De moes woort snel geanesthetiseerd mit koolstofdioxide en onthoof, de herses woorte snel oet de sjedel eweggehaold en ‘t met ies gevulde vibrerende mets (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Duitsland) woort gebruuk um ‘m in 300 tot 375 μm sagittale secties te snije en koolstofgaasvorming en koolstofgaasering (25% O) (25% O) Lieg Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 en 6,0 mM MgCl2 Pas aon pH tot 37 en 30 mO). Breng de verkrege hersensnijde euver nao ‘n kamer mit ‘n hoeger Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 ml Ca2 mM en 25,5 mM pH 7,4 en 310 tot 320 mOsm). Bewaar de sjeije 20 tot 30 minute zodat ze kinne were hersjtèld veurtot ze opnumme.
opname. Veur alle opnames woort ‘n microscooppodium gebruuk mit ‘n vaste opnamekamer en ‘n 20x water-immersie objectief (Scientifica). De vermeinde Purkinje-celle woorte geïdentificeerd door (i) liechaamsgrootte, (ii) anatomische locatie vaan ‘t cerebellum en (iii) expressie vaan ‘t fluorescerende mtYFP-reportergen. De patchpipet mit ‘n puntweerstand vaan 5 tot 11 megohm weurt oetgetrokke door ‘n borosilicaatglaas capillaire (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Duutsjland) en ‘n horizontale pipet Instruments (P-1000, Sutter, Sutter, CA). Alle opnames woorte oetgeveurd door ELC-03XS npi patch clamp versterker (npi electronic GmbH, Tam, Duitsland), die woort gecontroleerd door de software Signal (versie 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). ‘t Experimint woort geregistreerd mit ‘n bemonsteringssnelheid vaan 12,5 kHz. ‘t Signaal weurt gefilterd mit twie kortdoorlaot Besselfilters mit aafsjnijfrequenties vaan respectievelik 1,3 en 10 kHz. De kapacitans vaan ‘t membraan en de pipet weurt gecompenseerd door ‘t compensatiecircuit mit behulp vaan de versterker. Alle experiminte woorte oetgeveurd oonder de controle vaan ‘n Orca-Flash 4.0-camera (Hamamatsu, Gerden, Duitsland), die woort bestuurd door de Hokawo-software (versie 2.8, Hamamatsu, Gerden, Duitsland).
Routine-configuratie en analyse vaan de ganse cel. Vul de pipet vlak veur ‘t opnumme mit de interne oplossing die de volgende stoffe bevat: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumgluconaat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (MM), 0,5 mM Gunofosifaat. (GTP) (Na) en 10,0 mM creatininefosfaat woorte aongepas op pH 7,25, en de osmotische drök waor 290 mOsm (sucrose). Direk nao ‘t toepasse vaan ‘n krach vaan 0 pA um ‘t membraan te breke, woort ‘t rustende membraanpotentieel gemete. De invoerweerstand weurt gemete door hyperpolariseerde strouminge vaan -40, -30, -20 en -10 pA toe te passe. Meet de groetheid vaan de spanningsrespons en gebruuk Ohm’s wet um de invoerweerstand te berekene. Spontane activiteit woort 5 minute in un spanningsklem geregistreerd, en sPSC woort geïdentificeerd en gemete in Igor Pro (versie 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, VS) met behölp vaan un semi-automatisch herkenningsscript. De IV-curve en de steady-state-sjtroum were gemaete door de batterij op versjillende potentiële (vaan -110 mV) te klemme en de spanning in stappe vaan 5 mV te verhoege. De productie vaan AP woort getes door ‘n depolariserende sjtroum toe te passe. Klem de cel op -70 mV onderwieles dat geer un depolariserende sjtroumpuls toepas. Pas de stapgrootte vaan eder opname-einheid apaart aan (10 tot 60 pA). Bereken de maximale AP-frequentie door de pulspike die de hoegste AP-frequentie veroorzake, handmatig te tèlle. De AP-drempel weurt geanalyseerd door de twiede aafgeleid vaan de depolarisatiepuls te gebruke dee iers ein of mie AP’s activeert.
Configuratie en analyse vaan geperforeerde patch. Voer geperforeerde patch-opname oet met behulp vaan standaardprotocolle. Gebruuk un ATP- en GTP-vrije pipet die neet de volgende ingrediënte bevat: 128 mM gluconaat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA en 2 mM MgCl2, en pas de pH 7,2 aan (met KOH). ATP en GTP weure weggelaote oet de intracellulaire oplossing um ongecontroleerde permeabiliteit vaan ‘t celmembraan te veurkoume. De pleisterpipet weurt gevöld mit ‘n amfotericine-bevattende interne oplossing (ongeveer 200 tot 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) um ‘n geponsde pleisterrecord te kriege. Amfotericine woort opgelos in dimethylsulfoxide (eindconcentratie: 0,1 tot 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). De gebruukde concentratie vaan DMSO had gein significant effek op de bestudeerde neurone. Tijdens ‘t ponsproces woort de kanaalweerstand (Ra) continu gecontroleerd, en ‘t experimint woort begós naodat de amplitude vaan Ra en AP waor gestabiliseerd (20-40 minute). Spontane activiteit weurt gemaete in ‘n spannings- en/of stroumklem veur 2 tot 5 minute. Data-analyse woort oetgeveurd mit Igor Pro (versie 7.05.2, WaveMetrics, VS), Excel (versie 2010, Microsoft Corporation, Redmond, VS) en GraphPad Prism (versie 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Vereinegde Staote). Um spontane AP’s te identificere, weurt de NeuroMatic v3.0c plug-in vaan IgorPro gebruuk. Identificeer AP’s automatisch mit behulp vaan ‘n bepaolde drempel, dee veur eder record individueel weurt aongepas. Bepaol mit ‘t spikeinterval de spikefrequentie mit de maximale direk spikefrequentie en de gemiddelde spikefrequentie.
PN-isolatie. Door zich aan te passe aan ut eerder gepubliceerde protocol, woorte PNs in un bepaolde stadium gezuuverd oet ut hersen vaan de moes (58). Kort samegevat, de cerebellum woort gedisseceerd en gemaald in ieskawwe dissociatiemedium [zónder HBSS Ca2+ en Mg2+, aongevöld mit 20 mM glucose, penicilline (50 U/ml) en streptomycine (0,05 mg/ml)], en vervolgens woort ‘t medium verteerd in papaïne [HBSS, aangevuld HBSS-steïne, (1 mg / ml), papaïne (16 U / ml) en deoxyribonuclease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Behandel 30 minute bij 30°C. Was de weefsels iers in HBSS-medium mit eislijm (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) en DNase (0,1 mg/ml) bij kamertemperatuur um enzymatische spijsvertering te veurkoume, en daonao in ‘t HBSS-medium mit 20 mM glucose Zachteg malen in HBSS-peilin, 50 mg/ml/ml, streep (0,05 mg/ml) en DNase (0,1 mg/ml) losse enkele celle los. De resulterende celsuspensie woort gefilterd door un 70μm celfilter, daonao woorte de celle gepelleteerd door centrifugatie (1110 rpm, 5 minute, 4°C) en hersuspendeerd in sorteermedium [HBSS, aongevuld mit 20 mM glucose, 20% foetale bovine ) Serum, peline (50/50) strepcylcin (0,05 mg/ml)]; evalueer de levensvatbaarheid vaan de cel mit propidiumjodide en pas de celdichtheid aan op 1×106 tot 2×106 celle/ml. Veur de flowcytometrie woort de suspensie gefilterd door un 50 μm celfilter.
Stroomcytometer. Celsortere woort oetgeveurd op 4°C mit behulp vaan FACSAria III machine (BD Biosciences) en FACSDiva software (BD Biosciences, versie 8.0.1). De celsuspensie woort gesorteerd mit behulp vaan un 100 μm spuitkop oonder un drök vaan 20 psi mit un snelheid vaan ~2800 gebeurtenisse/sec. Aongezeen traditionele gatingcriteria (celgrootte, bimodale discriminatie en versjpreiingskenmerke) neet kinne garandere veur de correcte isolatie vaan PN vaan aandere celtypes, is de gatingstrategie ingesteld op basis vaan de directe vergelieking vaan de YFP-intensiteit en autofluorescentie in mitoYFP+ ​​en de controle mitoYFP − muis. YFP weurt opgewonde door ‘t monster te besjtraole mit ‘n 488 nm laserlijn, en ‘t signaal weurt gedetecteerd met behölp vaan ‘n 530/30 nm banddoorlaotfilter. In mitoYFP+ ​​muis weurt de relatieve sterkde vaan ‘t Rosa26-mitoYFP-reportergen ouch gebruuk um neuronale liechaam en axonfragminte te ondersjeie. 7-AAD weurt opgewonde mit un 561 nm gele laser en weurt gedetecteerd mit un 675/20 nm bandpassfilter um doeje celle oet te slete. Um astrocyte tegeliekertied te sjeie, woort de celsuspensie gekleurd mit ACSA-2-APC, daonao woort ‘t monster besjtraold mit ‘n 640 nm laserlijn en woort ‘n 660/20 nm bandpassfilter gebruuk um ‘t signaal te detectere.
De verzamelde celle woorte gepelleteerd door centrifugatie (1110 rpm, 5 minute, 4°C) en bewaord bij -80°C tot gebruuk. Mfn2cKO-muis en hun nèspoppe were op dezelfde daag geclassificeerd um de variatie in de procedure te beperke. FACS-gegevenspresentatie en -analyse woorte oetgeveurd mit behulp vaan FlowJo-software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, VS).
Zoals heibove vermeld (59), weurt real-time PCR gebruuk um DNA te isolere vaan de gesorteerde neurone veur vervolgende mtDNA-kwantificering. De lineariteit en drempelgevoeligheid woorte in ‘t begin getes door qPCR op versjillende aantal celle oet te veure. Kort samegevat, verzamel 300 PN in un lysebuffer bestaonde oet 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 en proteinase K (200 ng/ml) en incubeer 120 minute bij 55°C. De celle woorte weijer 10 minute bij 95°C geïncubeerd um de volledige inactievering vaan proteinase K te verzekere. Mit ‘n TaqMan-probe (Thermo Fisher) specifiek veur mt-Nd1 woort mtDNA gemaete door semi-kwantitatieve PCR in ‘t 7900HT Real-Time PCR-systeem (Thermoherific Scientifics). Science, catalogusnummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer AIVI3E8) en 18S (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer Hs99999901_s1) gene.
Proteoommonsterveurbereijing. Door de oplossing 10 minute op 95°C te verhitte en te sonicere in de lysebuffer [6 M guanidinechloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) fosfienhydrochloride, 10 mM chloroacetamide en 100 mM tris-lyse bevrore neuronpellets in HC-pellets]. Op Bioruptor (Diagenode) veur 10 minute (30 seconde pols / 30 seconde pauzeperiode). ‘t Monster woort 1:10 verdund in 20 mM tris-HCl (pH 8,0), gemengd mit 300 ng trypsinegoud (Promega) en euvernach geïncubeerd bij 37°C um volledige spijsvertering te bereike. Op de twiede daag woort ‘t monster gecentrifugeerd op 20.000 g veur 20 minute. ‘t Supernatant woort verdunt mit 0,1% mierzuur en de oplossing woort ontzout mit zelfgemaakde StageTips. ‘t Monster woort gedroog in ‘n SpeedVac-instrumint (Eppendorf-concentrator plus 5305) bij 45°C, en daonao woort ‘t peptide gesuspendeerd in 0,1% mierzuur. Alle monsters woorte tegeliek door dezelfde persoen veurbereid. Um astrocytemonsters te analysere, woorte 4 μg onzoute peptides gelabeld mit un tandemmassa-tag (TMT10plex, catalogusnummer 90110, Thermo Fisher Scientific) mit un peptide-tot-TMT-reagensverhouding vaan 1:20. Veur TMT-labelling woort 0,8 mg TMT-reagens hersuspendeerd in 70 μl watervrije ACN, en ‘t gedroogde peptide woort gereconstitueerd in 9 μl vaan 0,1 M TEAB (triethylammoniumbicarbonaat), boe 7 μl TMT-reagens in ACN woort toegeveug. De concentratie waor 43,75%. Nao 60 minute vaan incubatie woort de reactie gedoof mit 2 μl vaan 5% hydroxylamine. De gelabelde peptides woorte verzameld, gedroog, hersuspendeerd in 200μl vaan 0,1% mierzuur (FA), in twie verdeild en vervolgens ontzout met behölp vaan zelfgemaakde StageTips. Mit behulp vaan UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) woort ein vaan de twie hèlfte gefractioneerd op ‘n 1mm x 150mm Acquity chromatografische kolom gevöld mit 130Å1.7μm C18 deilkes (Waters, catalogus No. SKU: 1966). Thermo Fisher Scientific). Sjeid peptides mit un stroumingssnelheid vaan 30μl/min, sjeid vaan 1% tot 50% buffer B veur 85 minute mit un stapsgewijs gradiënt vaan 96 minute, vaan 50% tot 95% buffer B veur 3 minute, daan 8 minute veur 95 % buffer B; Buffer A is 5% ACN en 10 mM ammoniumbicarbonaat (ABC), en buffer B is 80% ACN en 10 mM ABC. Verzamel fracties um de 3 minute en combineer ze in twie groepe (1 + 17, 2 + 18, enz.) en druug ze in un vacuümcentrifuge.
LC-MS/MS-analyse. Veur massaspectrometrie woorte de peptides (getal r119.aq) gesjeije op un PicoFrit-analytische kolom vaan 25 cm, 75 μm binnediameter (nuuj objectief lens, onderdeilnummer PF7508250) oetgerös mit 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ-AQ-medium (Maisch, Maisch-YAS), Maisch-YAS. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Duitsland). De kolom woort bij 50°C gehawwe. Buffers A en B zien 0,1% mierzuur in water en 0,1% mierzuur in 80% ACN, respectievelik. Peptides woorte gedurende 65 minute gesjeie vaan 6% tot 31% buffer B en vaan 31% tot 50% buffer B veur 5 minute mèt ‘n gradiënt vaan 200 nl/min. De geëlueerde peptides woorte geanalyseerd op un Orbitrap Fusion massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). De m/z-meting vaan de peptideprecursor weurt oetgeveurd mit ‘n resolutie vaan 120.000 in ‘t bereik vaan 350 tot 1500 m/z. Mit gebruuk vaan 27% genormaliseerde bótsingsenergie weurt de sterkste veurlouper mit ‘n ladingstoestand vaan 2 tot 6 geselecteerd veur ‘n hoeg-energie C-valdissociatie (HCD)-splitsing. De cyclustied is ingesteld op 1 s. De m/z-waarde vaan ‘t peptidefragmint woort gemaete in de ionval met behölp vaan ‘t kleinste AGC-doelwit vaan 5×104 en de maximale injectietied vaan 86 ms. Nao fragmentatie woort de veurluiper 45 s op de dynamische oetsjletingslies geplaots. TMT-gelabelde peptides woorte gesjeie op un 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-kolom (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer 164942), en de migratiespectra woorte geanalyseerd op un Orbitrap Lumos Tribrid massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) oetgerös mit asymmetrische golfvorme (IMS) apparatuur (Thermo Fisher Scientific) wèrk op twie compensatiespanninge vaan −50 en −70 V. MS3 geselecteerd op basis vaan de synchronisatieprecursor weurt gebruuk veur TMT-rapport ionsignaalmeting. De peptidesjeiing woort oetgeveurd op EASY-nLC 1200, met behulp vaan ‘n 90% lineaire gradiëntelutie, mit ‘n bufferconcentratie vaan 6% tot 31%; buffer A waor 0,1% FA, en buffer B waor 0,1% FA en 80% ACN. De analytische kolom weurt gebruuk bij 50°C. Gebruik FreeStyle (versie 1.6, Thermo Fisher Scientific) um ‘t orzjinele bestand te splitse volgens de FAIMS-compensatiespanning.
Eiwitidentificatie en kwantificering. Mit behulp vaan de geïntegreerde Andromeda-zoekmachine woorte de orzjinele data geanalyseerd mit behulp vaan MaxQuant versie 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). In aanvulling op de Cre-recombinase- en YFP-sequenties verkriege vaan Aequorea victoria, woorte peptidefragmentspectra gezoch nao de canonieke sequentie en isovörmsequentie vaan ‘t moesreferentieproteoom (Proteome ID UP000000589, gedownload vaan UniProt in mei 2017). Methionine-oxidatie en eiwit N-terminale acetylatie woorte ingesteld es variabele modificaties; cysteïnecarbamoylmethylatie woort ingesteld es vaste modificaties. De spijsverteringsparameters zien ingesteld op “specificiteit” en “trypsine/P”. ‘t Minimum aontal peptides en scheermespeptides dat weurt gebruuk veur eiwitidentificatie is 1; ‘t minimum aantal unieke peptide is 0. Oonder de umstandeghede vaan peptidemap matching waor de eiwitidentificatiefrequentie 0,01. De optie “Twiede Peptide” is ingeschakeld. Gebruik de optie “match between runs” um succesvolle identificaties tusse versjillende orzjinele bestande euver te drage. Gebruik LFQ minimum ratio tèlling 1 veur labelvrije kwantificering (LFQ) (60). De LFQ-intensiteit weurt gefilterd veur op z’n mins twie geldige waarde in op z’n mins ein genotypegroep op eder tiedspunt, en weurt geëxtrapoleerd vaanoet ‘n normale verdeiling mit ‘n breedte vaan. 0,3 en 1,8 nao oonder. Gebruik ‘t Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) en R (https://r-project.org/) um de LFQ-resultate te analysere. ‘n Twie-weg gematigde t-test oet ‘t limma-softwarepakket woort gebruuk veur ‘n differensjele expressieanalyse (61). Verkennende dataanalyse weurt oetgeveurd mit behulp vaan ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally en pheatmap. De op TMT gebaseerde proteomische data woorte geanalyseerd mit behulp vaan MaxQuant versie 1.6.10.43. Zeuk nao ruwe proteomische data oet de minseleke proteomische databank vaan UniProt, die in september 2018 is gedownload. De analyse umvat de isotoopzuverheidscorrectiefactor die door de fabrikant is aongeboje. Gebruik limma in R veur differensjele expressieanalyse. De originele data, de zeukresultate in de databank en de workflow en resultate vaan de dataanalyse weure allemaol opgeslage in de ProteomeXchange-alliantie via de PRIDE-partnerrepository mit de dataset-identificator PXD019690.
Functionele annotaties verrieke de analyse. ‘t Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN)-hulpmiddel woort gebruuk um de riekdom vaan de functionele annotatieterme vaan de dataset op 8 weke te bepaole (Figuur 1). Kort samegevat, de kwantitatieve eiwitlies verkriege oet LC-MS/MS (tandem massaspectrometrie) gegevensanalyse weurt gebruuk mit de volgende filtercriteria: Mus musculus weurt geselecteerd es de soort en de achtergroond, en de categorie toont dat de P-waarde die door Benjamini is aongepas veur verrieking vaan 0,05 of lieger weurt es significant besjouwd. Veur deze grafiek weure de top vief euversjootcategorieje in eder cluster gebaseerd op de aongepaste P-waarde getoend. Mit behulp vaan mierdere t-test, mit behulp vaan ‘t twietraps lineaire boostprogramma vaan Benjamini, Krieger en Yekutieli (Q = 5%), weurt ‘n tiedsloup-eiwitexpressieanalyse oetgeveurd op de belangrieke kandidate die in eder categorie zien geïdentificeerd, en eder rij weurt apaart geanalyseerd. D’r is gein behoefte um ‘n consistente SD aon te numme.
Um de resultate vaan dit oonderzeuk te vergelieke mèt gepubliceerde databanke en ‘n Venn-diagram in Figuur 1 te generere, höbbe veer de kwantitatieve eiwitlies gecombineerd mèt MitoCarta 2.0-annotaties (24). Gebruik ut online tool Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) um ut diagram te generere.
Veur gedetailleerde informatie euver de statistische procedures die gebruuk weure veur proteomische analyse, verwies nao de euvereinkomstig sectie vaan Materiale en Methodes. Veur alle aandere experiminte is gedetailleerde informatie te vinde in de euvereinkomstig legende. Tenzij anders vermeld, weure alle data oetgedruk es gemiddelde ± SEM, en alle statistische analyses woorte oetgeveurd met behölp vaan GraphPad Prism 8.1.2 software.
Veur aanvullende materiaal veur dit artikel, zuug http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dit is un open touwgaank artikel verspreid oonder de veurwaardes vaan de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, die ‘t gebruuk, verspreiding en reproductie in eder medium meugelek maak, zolaank ‘t oeteindelek gebruuk neet veur commercieel gewin is en ‘t oetgangspunt is dat ‘t orzjineel werk korrek is. Referens.
Opmerking: Ver vraoge uuch allein um eur e-mailadres op te geve zodet de persoen dee geer aon de pagina aanbeveelt weit dat geer de e-mail wilt zeen en dat ‘t gein spam is. We zulle gein e-mailadresse vastlègke.
Deze vraog weurt gebruuk um te teste of geer un bezeuker zit en um automatische spam-inzending te veurkómme.
Door E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomische analyse vaan dysfunctionele neurone onthulde dat metabolische programma’s geactiveerd zien um neurodegeneratie tege te goon.
Door E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomische analyse vaan dysfunctionele neurone onthulde dat metabolische programma’s geactiveerd zien um neurodegeneratie tege te goon.
©2020 Amerikaanse Vereineging veur de Veuroetgaank vaan de Weitesjap. alle rechte veurbehawwe. AAAS is un partner vaan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.