Huidig ​​adres: OX11 0DE, Vereineg Keuninkriek, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Vereineg Keuninkriek, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
‘t Reactiecentrum leech-oegscomplex 1 (RC-LH1) is ‘t kernfotosynthetische oonderdeil vaan paarse fototrofe bacterieje. We höbbe twie cryo-elektronmicroscopiestructure vaan ‘t RC-LH1-complex vaan Rhodopseudomonas palustris geïntroduceerd. De 2,65-Å-resolutiestructuur vaan ‘t RC-LH114-W-complex besteit oet 14 subeenheid LH1-lusse um RC heen, wat weurt oonderbroke door eiwit W, terwijl ‘t complex zoonder eiwit-W volledig RC-samestèlling is umgeve door RC. LH1-lus vaan 16 subeenhede geslote. De vergelieking vaan dees structure gief inziech in de dynamiek vaan quinon in ‘t RC-LH1-complex, boe-oonder veurheen neet bepaolde conformationele veranderinge bij ‘t binden vaan quinon op de RC QB-locatie, zoewie de locatie vaan extra quinon-bindingsplaotse, die helpe um ze nao RC door te geve. De unieke structuur vaan ‘t W-eiwit veurkomt de sleting vaan de LH1-lus, en oontsteit zoe ‘n kanaal veur ‘t versnelle vaan de quinon/quinoloon-oetwisseling.
De energie die weurt opgeleverd door fotosynthese kin bekans alle leve op aarde in stand hawwe en heet groet potensjeel veur zonne-energiebiotechnologie. Oonderwieles dat ze globale fotosynthese bevordere, vertoene paorse fototrofe bacterieje ouch versjillende energiemodi en stofwisseling. Ze kinne fotosynthese veurkómme en greuje es heterotrofe bacterieje in ‘t duuster, kinne stikstof en koolstofdioxide fixere, waterstof producere en aromatische verbindinge aafbreke (1-3). Um energie veur dees processe te levere, mot leech snel en efficiënt weure umgezat in chemische energie. Dit proces begint es ‘t leechvangende antennecomplex leech absorbeert en de vasgevange energie euverbringt nao ‘t reactiecentrum (RC), boedoor de ladingsjeiing begint (4 – 7). De basiseenheid vaan fotosynthese in paorse fototrofe bacterieje besteit oet type 2 RC, umgeve door leech-oogste complex 1 (LH1), wat ‘t RC-LH1 kerncomplex vörmp. LH1 weurt gevörmp door ‘n array vaan gebogde αβ-heterodimere, boevaan eder twie bacteriële chlorofyl (BChl) molecule en ein of twie carotenoïde bindt (8-12). De eenvoudigste LH1-antenne besteit oet 16 of 17 αβ-heterodimere die RC (9-13) in ‘n geslote lus umringe, mer in aandere kerncomplexe oonderbreke transmembraanpeptides de continuïteit vaan de umringende LH1, boedoor de quinol/quinondiffusie tusse RC en cytochroom bccomplex weurt bevordere (1111). De paorse fototrofe plant Rhodopseudomonas (Rps.) is ‘n modelorganisme det de energie en elektrone euverdrach kin begriepe dee fotosynthese ondersteunt. De ierste kristalstructuur vaan Rps. ‘t Model vaan ‘t palustris RC-LH1-complex is RC, umgeve door 15 heterodimere LH1-lusse, die weure oonderbroke door ‘n oonbekind eiwit genaomp “Eiwit W” (14). Eiwit-W woort vervolgens geïdentificeerd es RPA4402, wat un neet gekarakteriseerd 10,5kDa eiwit is mit drie veurspelde transmembraan helices (TMH) (16). Ver stèlle veur um ut rpa4402-gen dat eiwit W codeert te hernumme nao pufW um in lijn te zien mit de nomenclatuur die weurt gebruuk veur gene die RC-L, M (pufL, pufM) en LH1α, β (pufA, pufB) sub-einhede codere. Interessant is dat eiwit-W mer aonwezig is in oongeveer 10% vaan RC-LH1, wat Rps aonguuf. palustris produceert twie versjillende RC-LH1-complexe. Hei rapportere veer de hoegresolutie cryo-EM (cryo-EM) structure vaan twie kerncomplexe, ein mit eiwit W en 14 αβ heterodimere, de aandere zoonder eiwit W en ‘n geslote 16 Heterodimer LH1 lus. Ozze structuur representeert un stapverandering in ut begrip vaan ut RC-LH1-complex vaan Rps. palustris, umtot ver de homogene populatie vaan eder variant höbbe geanalyseerd en voldoende resolutie höbbe um eder peptide en geboonde pigmente en gerelateerde lipide en quinone dudelik touw te wijze. De vergelieking vaan dees structure toent aon dat de drei TMH-eiwitte-W die tot noe touw in gein aander RC-LH1-complex zien gevoonde, ‘n quinonkanaal generere um de quinon/quinoloon-oetwisseling te versnelle. ‘n Aontal geconserveerde lipide- en quinonbindingsplaotse zien geïdentificeerd, en veer höbbe ‘n nuie conformationele verandering aongetoond nao de combinatie vaan quinon en RC, die gesjik kin zien veur fotosysteem II (PSII) RC vaan zuurstofgevölde fototrofe organisme. Ozze bevindinge geve nuuj inzich in de kinetica vaan quinon/quinoloonbinding en oetwisseling in ‘t RC-LH1-kerncomplex vaan paarse fototrofe bacterieje.
Um un gedetailleerde studie vaan de twie complexe die in Rps te vinde zien, te vergemekeleke. palustris, isolere veer eder RC-LH1 door biochemische methodes. ‘t Eiwit W-deficiënte complex (hie-nao ΔpufW geneump) woort gezuuverd vaan de stam dee ‘t pufW-gen misde (16), en mer ein RC-LH1-complex kin weure geproduceerd. Ut eiwit W-bevattende complex weurt geproduceerd door un stam. ‘t Eiwit W vaan dees stam is gemodificeerd mit ‘n 10x His-tag aon de C-eind, zoetot ‘t eiwit W-bevattende complex effectief kin weure gecombineerd mit ‘t mieste ontbrekende eiwit W door metaal te immobilisere. ‘t Complex is effectief gesjeie (16) Affinity Chromatografie (IMAC).
Zoals in Figuur 1 te zien is, bevatte beide complexe ‘n RC (RC-L, RC-M en RC-H) mit drie sub-eenhede, umgeve door ‘n LH1-antenne. De 2,80-A-structuur vaan ‘t complex mit gein eiwit-W toent 16 αβ-heterodimere, die ‘n geslote LH1-lus vörme die gans um RC umgief, hiernao ‘t RC-LH116-complex geneump. De 2,65Å structuur vaan ‘t eiwit-W-bevattende complex heet ‘n 14-heterodimeer LH1 oonderbroke door eiwit-W, hiernao RC-LH114-W geneump.
(A en B) Oppervlaktevertegenwoordiging vaan de samesjtèlling. (C en D) Gekoppelde pigmente oetgedruk in stange. (E en F) De complexe die weure gezeen vaanoet ‘t cytoplasmatische oppervlak höbbe de peptides en LH1-subeinhede die in stripverhaole weure weergegeve, en zien tege de riechting vaan de klok genummerd vanaaf de eiwit-W-kloof [consistent mit Rba-nummering. sphaeroides complex (13)]. Veur LH1-α is de kleur vaan de eiwitsub-eenheid geel; veur LH1-β is de kleur vaan de eiwitsub-eenheid blauw; veur eiwit-W is ‘t eiwit roed; veur RC-H is ut cyan; veur RC-L is ut oranje; veur RC-M, magenta. Cofactore weure weergegeve door stange, greun steit veur BChl- en BPh a-molecule, paors steit veur carotenoïde en geel steit veur UQ10-molecule. (G en H) Vergroete weergave vaan de eiwit-W-kloof in ‘t gelieke regio vaan RC-LH114-W-complex (G) en RC-LH116-complex (H). Cofactore weure weergegeve in de vörm vaan ruimtevölling, gechelateerde quinon weurt in blauw weergegeve. De eiwit-W-kloof is gemarkeerd door ‘n blauw gesjtriep lijn in (G), en de kleine gate boe-in quinon/quinolol diffundeert op de LH116-ring zien gemarkeerd door ‘n zwarte gesjtriep lijn in (H).
Figuur 1 (A en B) toent de RC umgeve door open of geslote arrays vaan LH1αβ heterodimere, die elk twie BChl en ein carotenoïde bindt (Figuur 1, C en D). Iedere studies höbbe aongetoond dat Rps ‘t LH1-complex is. In de biosynthetische weeg vaan spirulina xanthine bevatte dees soorte gemengde populaties vaan carotenoïde (17). Spiropyrroxanthin is echter de dominante carotenoïde en zien dichtheid is bevreidigend. Daorum höbbe veer d’r veur gekoze um spiroxanthin op alle LH1-bindingsplaotse te modellere. De alfa- en beta-polypeptide zien enkele TMH’s mit korte membraan boeteregio’s (Figuur 1, A, B, E en F). Alhoewel de dichtheid vaan 17 residue aon de C-eind neet woort gezeen, woort ‘t alfa-polypeptide in beide complexe vaan Met1 tot Ala46 gesplits. β-polypeptide woort gereduceerd vaan Gly4 tot Tyr52 in RC-LH116, en vaan Ser5 tot Tyr52 in RC-LH114-W. D’r woort gein dichtheid vaan 3 of 4 N-terminale of 13 C-terminale residue woergenome (Figuur S1). Massaspectrometrieanalyse vaan ‘t gemengde RC-LH1-complex veurbereid oet de wild-type-stam leet zien dat ‘t oontbrekende gebeed ‘t resultaat waor vaan heterologe splitsing vaan dees peptide (Figuur S1 en S2). De N-terminale formylatie vaan α-Met1 woort ouch gezeen (f). De analyse leet zien dat ‘t α-peptide besteit oet residue fMet1 tot Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, en ‘t β-peptide besteit oet residue Ser2 tot Ala53, wat good euvereinkump mit de EM-dichtheidskaart mit liege temperatuur.
Coördinatie vaan α-His29 en β-His36 maak BChls gezich tot gezich; eder αβ-heterodimeer stèlt zich same mit zien naobers um ‘n ope lus (RC-LH114-W) of ‘n geslote lus (RC-LH116) roond de RC te vörme. Vergeleke mit de 877 nm band vaan RC-LH114-W is de 880 nm absorptie-roej versjuiving vaan RC-LH116 3 nm (Figuur 2A). ‘t Cirkelvormige dichroïsmespectrum is echter bekans ‘tzelfde (Figuur 2B), wat aonguuf dat de lokale umgeving vaan BChls, hoewel d’r ‘n duudelik versjil is tusse open en geslote lusse, erg geliek is. De absorptieroedversjuiving kin ‘t resultaat zien vaan verminderde thermische beweging en verhoegde stabiliteit op de geslote lus (18, 19), de verandering in pigmentkoppeling veroorzaak door de geslote lus (20, 21), of ‘n combinatie vaan dees twie effecte (11).
(A) Ultraviolet/ziechbaar/nao-infraroed absorptiespectrum, boevaan de pieke zien gemarkeerd mit hun euvereinkomstig pigmente en genormaliseerd op de BPh-piek op 775 nm. (B) Circulair dichroïsmespectrum genormaliseerd op BChl-absorptie bij 805 nm. (C en D) Geselecteerde ΔA-spectra oet de tied-opgeloste absorptiespectra vaan RC-LH114-W-complex (C) en RC-LH116-complex (D). Veur betere vergeliekbaarheid were alle spectra genormaliseerd tot ∆A vaan −A bie 0,2 ps. (E) De snelheid vaan cytochroom c2-oxidatie nao besjtraoling in de aonwezigheid vaan versjèllende concentraties vaan UQ2 (zuug aafbeelding S8 veur ruwe gegeves). (F) In celle die greujde oonder leech vaan lieg, middel of hoeg intensiteit (10, 30 of 300μMm-2 s-1, respectievelik), de eiwit W en RC-L sub-einhede in ‘t gezuuverde complex en de gesjeie membraanverhouding. Bepaol ‘t eiwitniveau door SDS-polyacrylamidegelelektroforese en immunoassay (zuug Figuur S9 veur ruwe data). Bepaal de ratio ten opziechte vaan ‘t gezuuverde RC-LH114-W-complex. De stoïchiometrische ratio vaan RC-L tot eiwit-W vaan ‘t complex is 1:1.
De BChls op positie 1 in de vervormde αβ14-lus vaan RC-LH114-W (Figuur 1, A, C en E) ligke 6,8Å dichter bij de RC-primaire donor (P) es de equivalente BChls in RC-LH116 (Figuur 1, B, D, en F, en S3); de veurbiegende absorptiekinetica vaan de twie complexe toent echter aon dat veur RC-LH114-W en RC-LH116 de excitatie-energie-euverdrachstiedconstante vaan LH1 nao RC 40 ±4 en 44±3 ps zien (Figuur 2). , C en D, Figuur S4 en Tabel S2). D’r is ouch gein significant versjil in elektronische euverdrach binne RC (Figuur S5 en gerelateerde aanvullende teks). Ver vermoede dat de nauwe correspondentie vaan de energie-euverdrachstied tösse LH1 en RC-P te danke is aon de vergeliekbaar aafsjtand, hook en potentieel energie vaan de mieste BChl in de twie LH1-lusse. ‘t Liek d’rop dat ‘t verkinne vaan ‘t LH1-energiepatroon um de minimum aafsjtand te bereike neet sneller is es ‘n directe energie-euverdrach vaan suboptimale locaties nao RC. De open-loop LH1-lus in RC-LH114-W kin ouch onbelangrieke thermische beweging ondergaon oonder umstandeghede vaan liege temperatuur veur structurele analyse, en d’r is ‘n langere αβ14-ringconformatie bij kamertemperatuur vanaaf de pigmentatie-aofstand vaan βBChls op de positie vaan RC 1.
‘t RC-LH116-complex bevat 32 BChls en 16 carotenoïden, en de algehele rangsjikking is ‘tzelfde es dee verkriege vaan Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB-stam (PDB077) (2977)) en greune alge (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Nao uitlijning woorte allein kleine aafwiekinge in de posities vaan αβ-heterodimere gezeen, veural 1-5, 15 en 16 (Figuur S6). De aanwezigheid vaan eiwit-W heet ‘n significante invlood op de structuur vaan LH1. De drei TMH’s zien verboonde door korte lusse, mit ‘t N-eind aon de lumenkant vaan ‘t complex en ‘t C-eind aon de cytoplasmatische kant (Figure 1A en 3, A tot D). Eiwit-W is groetendeils hydrofobisch (Figuur 3B), en TMH2 en TMH3 höbbe interactie met LH1αβ-14 um un transmembraan oppervlak te vörme (Figuur 3, B en E tot G). ‘t Interface besteit veural oet Phe-, Leu- en Val-residue in ‘t transmembraangebeed. Dees residue zien gestapeld mit hydrofobische aminozure en αβ-14-pigmente. Sommige polaire residue drage ouch bij aon de interactie, boe-oonder de waterstofbinding tusse W-Thr68 en β-Trp42 op ‘t oppervlak vaan de complexe holte (Figuur 3, F en G). Op ‘t oppervlak vaan ‘t cytoplasma ligk Gln34 naeve de keto-groep vaan αβ-14 carotenoïde. Daoneve woort ‘t n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) molecuul opgelos, en zien hydrofobische staart strekde ziech oet tot ‘t grensvlak tusse eiwit-W en αβ-14, en de lipide staart kin zich in ‘t lief bevinde. We höbbe ouch opgemerk dat de C-terminale resolutiegebiede vaan eiwit W en RCH hiel kortbie ligke, mer neet binne de umvang vaan ‘t vörme vaan specifieke interacties (Figuur 1, A en E). D’r kinne echter interacties zien in de onopgeloste C-terminale aminozure vaan dees twie eiwitte, die ‘n mechanisme kinne oplevere veur de werving vaan eiwit-W tijdens de montage vaan ‘t RC-LH114-W-complex.
(A) Eiwit-W, dat in cartoonvörm op ‘t grensvlak mèt LH1αβ14 kiek, heet ‘n staafvörmige zijketting (roed), weergegeve in ‘n deil vaan ‘t elektrostatisch potentieeldiagram (transparant gries oppervlak mèt ‘n contourniveau vaan 0,13). (B) Eiwit-W vertegenwoordigd door un hydrofob gekleurd oppervlak. Polaire en gelaoje gebaeje were in cyan, hydrofobiese gebaeje in wit en sterk hydrofobiese gebaeje in oranje. (C en D) Eiwit-W weergegeve in stripverhaol, de richting is dezelfde es in (A) (C), en is 180° gedreijd (D). Volgens de positie in de volgorde, numme de ondersjeidbare residue ‘n regeboagkleursjema aon, boebij de N-terminal blauw is en de C-terminal roed. (E) Eiwit-W in dezelfde weergaaf es in (A), en de residue op ‘t grensvlak vaan eiwit-W:LH1 weure weergegeve door stange mit bevestigde merke. (F) Eiwit-W is 90° gedreijd ten opziechte vaan (E) en LH1αβ14 in de cartoonrepresentatie, en ten opziechte vaan de interfaceresidue in de staafvertegenwoordiging. De euverhangende residue vaan ‘t beta-polypeptide zien gelabeld. De cofactor weurt getoend es ‘n balk dee euvereinkeump mèt de kleur vaan Figuur 1, de ontbinde β-DDM weurt in gries getoend en de zuurstof weurt in roed getoend. (G) De weergave in (F) is 180° gedreijd, mit de prominente residue vaan ‘t gelabelde alfa-polypeptide.
Eiwit-W verving ‘n αβ-heterodimere (de 15e in Figuur 1F), boedoor ‘t lus sluit en de ierste drei αβ-heterodimere weurt gekanteld. D’r woort gezeen dat de maximale hellingshook vaan de ierste αβ-1 heterodimeer ten opziechte vaan de filmnormale 25° tot 29° waor (Figuur 1, A en E), wat woort gevörmp door de 2° tot 8° helling vaan αβ-1 in RC A scherp contrast-LH116 (Figuur 1, B en F). De twiede en derde heterodimere zien helling vaan 12° tot 22° en 5° tot 10°, respectievelik. Vaanwege de sterieke hindernis vaan RC, umvat de helling vaan αβ-1 neet ‘t twiede paar αβ (wat euvereinkeump mèt de 16e αβ in Figuur 1F), en vörmp dus ‘n dudeleke kloof in de LH1-ring (Figuur 1, A en E) . Door ‘t gebrek aon twie αβ-heterodimere, same mit ‘t verlees vaan veer BChl en twie carotenoïde, bindt gein vaan de carotenoïde aon de verdraaide αβ-1 subeinheid, wat resulteert in ‘n LH114-W-ring mèt 13 carotenoïde Vegetarian en 28 BChls. De lokale resolutiesjattinge vaan de twie complexe in de αβ1 tot 7 regio’s zien lieger es die vaan de res vaan de LH1-lus, wat de inherènte plasticiteit vaan de LH1-subeinheid naeve de RC QB-site kin weerspiegele (Figuur 4) .
De aafbeeldinge vaan RC-LH114-W (A en B) en RC-LH116 (C en D) zien getoend vaanoet dezelfde boven-/zijkant (A en B) (A en C) en holte oppervlak vaan Fig. 1. (B en D). De gekleurde toetse zien rechs te zeen.
‘t Insigste aandere karakteristieke kerncomplex mit ‘n stoichiometrische ratio vaan 1:14 is de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Eiwit W en PufX höbbe echter gein dudelike homologie en höbbe ‘n significante invlood op hun respectievelike LH1-structure. PufX is un inkele TMH mit un N-terminaal cytoplasmatisch domein dat interageert mit de cytoplasmatische kant vaan de RC-H subeenheid (13) op un positie die euvereinkeump mit Rps. palustris LH116αβ-16. PufX creëert un kanaal veur de quinon/quinoloon-oetwisseling tusse RC-LH1 en ut cytochroom bcl-complex en is aanwezig in alle Rba. sphaeroides core complex (13). Alhoewel de monomeer-monomeer grensvlak in Rba is. De sphaeroides RC-LH1-PufX dimeer ligk op de bindingspositie vaan eiwit W in RC-LH114-W, en de kloof geïnduceerd door PufX en eiwit-W ligk op ‘n gelieke positie (Figuur S7A). De kloof in RC-LH114-W is ouch in lijn mit ‘t hypothetische quinonkanaal (8) vaan Pseudomonas rosea LH1, wat is gevörmp door peptides die neet gerelateerd zien aon eiwit W of PufX (Figuur S7B). Daoneve is ‘t quinonkanaal in Blc. De smaragdgreune LH1, gevörmp door ein γ-sub-einheid (7) oet te slete, bevindt zich op ‘n soortgelieke positie (Figuur S7C). Alhoewel gemedieerd door versjillende eiwitte, liek de versjijning vaan dees quinon/quinolol kanale in ‘n gemeinsjappeleke positie in ‘t RC-LH1-complex ‘n veurbeeld te zien vaan convergerende evolutie, wat aonguuf dat de kloof dee door eiwit W weurt gecreëerd es ‘n quinonkanaal kin fungere.
De kloof in de LH114-W-lus maak ‘t vörme vaan ‘n doorloupende membraangebeed meugelek tusse de interne ruimte vaan ‘t RC-LH114-W-complex en ‘t bulkmembraan (Figuur 1G), in plaots vaan de twie domeine via ‘n eiwitporie wie in eiwitte te verbinde. ‘t RC-LH116-complex is vergeliekbaar mit ‘n geslote Tch. Naold-achtig complex (22) (Figuur 1H). Umdet de diffusie vaan quinon door ‘t membraan sneller is es de diffusie door ‘t smalle eiwitkanaal, kin de ope LH114-W-lus ‘n snellere RC-omzet meugelek make es de geslote LH116-lus, en de diffusie vaan quinon in de RC kin mie beperk zien. Um te teste of eiwit W de conversie vaan quinone via RC beïnvlood, höbbe veer ‘n cytochroom-oxidatie-assay oetgeveurd op ‘n bepaolde concentratie vaan ubiquinon 2 (UQ2) (‘n analoog vaan natuurlike UQ10 mèt ‘n kortere isopreenstaart) (Figuur 2E). Alhoewel de aanwezigheid vaan gechelateerd quinon de nauwkeurige bepaoling vaan de sjijnbare Michaelis-constante belemmert (RC-LH114-W en RC-LH116 zien gesjik veur respectievelik 0,2±0,1μM en 0,5±0,2μM), is de maximale snelheid vaan RC-LH114-W ( 4,6±0,20,2μM) 28±5% groeter es RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Ver sjatte in ‘t begin dat eiwit-W in ongeveer 10% vaan ‘t kerncomplex aonwezig is (16); hei zien de bezettingspercentages vaan greujcelle mit weinig leech, middelmatig en hoeg leech 15±0,6%, 11±1% en 0,9±0,5, respectievelik % (Figuur 2F). Kwantitatieve vergelieking vaan massaspectrometrie leet zien dat de toevoeging vaan histidine-tag de relatieve euvervloed vaan eiwit-W neet verminderde in vergelieking mèt wildtype-stamme (P = 0,59), dus dees niveaus zien gein artefact vaan gemodificeerd eiwit-W (Figuur S10). Dees liege bezetting vaan eiwit-W in ‘t RC-LH1-complex kin echter sommige RC’s toelaote um op ‘n versnelde snelheid te umkiere, boedoor de langzamere quinon/quinoloon-oetwisseling in ‘t RC-LH116-complex weurt verzach. We höbbe opgemerk dat de hoege leechbezetting inconsistent is mit de recente transcriptomische data, wat aongief dat de pufW-genexpressie oonder sterk leech nump touw (Figuur S11) (23). ‘t Versjèl tösse pufW-transcriptie en eiwit-W-incorporatie in ‘t RC-LH1-complex is verwarrend en kin de complexe regulering vaan ‘t eiwit weerspiegele.
In RC-LH114-W zien 6 cardiolipine (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) en 29 β-DDM molecule touwgeweze en gemodelleerd 6 CDL’s, 24 POPC’s, 2 POPG’s en 12βDβ’s. RC-LH116 (Figuur 5, A en B). In dees twie structure bevindt zich CDL bekans op de cytoplasmatische kant vaan ‘t complex, onderwieles dat POPC, POPG en β-DDM zich veural op de luminale kant bevinde. Twee lipide- en wasmiddelmolecule woorte geïsoleerd in ‘t αβ-1 tot αβ-6 gebeed vaan ‘t RC-LH114-W-complex (Figuur 5A), en vief woorte geïsoleerd in ‘t equivalente gebeed vaan RC-LH116 (Figuur 5B). Aan de aandere kant vaan ‘t complex woorte mie lipide gevoonde, veural CDL, opgebouwd tusse RC en αβ-7 tot αβ-13 (Figuur 5, A en B). Anger structureel opgelosde lipide en wasmiddele bevinde zich boete de LH1-ring, en good opgelosde acylkettinge strekke zich oet tusse LH1-sub-einhede, veurlopig aongeduid es β-DDM in RC-LH114-W, en gedefinieerd es β-DDM in RC ‘n mengsel vaan β-DDM en PO-LH116-LH16. De soortgelieke posities vaan chelaterende lipide en wasmiddele in ós structuur wieze op dat ze fysiologisch relevante bindplaotse zien (Figuur S12A). De posities vaan geliekweerdege molecule in Tch höbbe ouch ‘n gooje consistentie. Zach en Trv. Stam 970 RC-LH1s (Figuur S12, B tot E) (9, 12) en de waterstofbindingsresidue vaan de lipide kopgroep toonde ‘n redelik gooje conservatie in de sequentie-aoflijning (Figuur S13), wat aongief dat dees locaties in ‘t RCH-LH1-complex bij behawwe CDL (24) kinne weure bewaord.
(A en B) RC-LH114-W (A) en RC-LH116 (B) peptides weure weergegeve door cartoons, en de pigmente weure weergegeve door stange, gebruukmakend vaan ‘t kleursjema in Figuur 1. Lipides zien in roed getoend, en wasmiddele zien in gries. UQ geboonde aon RC QA- en QB-sites is geel, terwijl geïsoleerde UQ blauw is. (C en D) Dezelfde visie es (A) en (B), mit lipide weggelaote. (E tot G) Vergroete weergaaf vaan Q1(E), Q2(F) en Q3(G) vaan RC-LH116, mit zijkettinge die mekaar beïnvleuje. De waterstof bindinge weure getoend es zwarte gesjtriep lijne.
In RC-LH116 zien zoewel RC QA es QB UQ, die deilnumme aan de elektroneuverdrach in ‘t laojingssjeijingsproces, ontbind op hun bindingsplaatse. In RC-LH114-W is QB-quinon echter neet opgelos en zal ‘t hieronder in detail weure besjproke. Neve QA- en QB-quinone zien twie gecheleerde UQ-molecule (tusse de RC- en LH1-ringe) touwgeweze in de RC-LH114-W-structuur volgens hun good opgeloste kopgróppe (respectievelik in Q1 en Q2). ruimte). Figuur 5C). Twee isopreen-einhede zien touwgeweze aon Q1, en de dichtheidskaart lost de complete 10 isopreen-staarte vaan Q2 op. In de structuur vaan RC-LH116 woorte drei gecheleerde UQ10-molecule (Q1 tot Q3, Figuur 5D) opgelos, en alle molecule höbbe ‘n heldere dichtheid door de ganse sjtart (Figuur 5, D tot G). In de twie structure höbbe de posities vaan de quinonkopgróppe vaan Q1 en Q2 ‘n oetstekende consistentie (Figuur S12F), en ze höbbe allein interactie mit RC. Q1 ligk bij de ingaank vaan de W-kloof vaan RC-LH114-W (Figuur 1G en 5, C, D en E), en Q2 ligk in de buurt vaan de QB-bindingsplaats (Figuur 5, C, D) en F). De geconserveerde L-Trp143 en L-Trp269 residue ligke hiel kortbij Q1 en Q2 en beeje potentiële π-stapelinteracties (Figuur 5, E en F, en Figuur S12). L-Gln88, 3,0 Å vaan de distale zuurstof vaan Q1, zörg veur ‘n sterke waterstofbinding (Figuur 5E); dit residu is bewaord in alle RC’s behalve de meis aafgelege relatie (Figuur S13). L-Ser91 weurt conservatief vervange door Thr in de mieste aandere RC’s (Figuur S13), is 3,8 Angstrom vaan de methylzuurstof vaan Q1 en kin zwakke waterstofbindinge oplevere (Figuur 5E). Q3 liek gein specifieke interactie te höbbe, mer is gelege in ‘t hydrofobische regio tösse de RC-M-subeinheid en de LH1-α-subeinheid 5 tot 6 (Figuur 5, D en G). Q1, Q2 en Q3 of in de buurt gecheleerde quinone zien ouch opgelos in Tch. Zach, Trv. Stam 970 en Blc. De irisstructuur (9, 10, 12) wies nao un geconserveerde auxiliaire quinonbindingsplaats in ut RC-LH1-complex (Figuur S12G). De vief ontbinde UQ’s in RC-LH116 zien in good euvereinstumming mit de 5,8±0,7 vaan eder complex bepaold door hoegprestatie vloeistofchromatografie (HPLC), terwijl de drei ontbinde UQ’s in RC-LH114-W lieger zien es De gemete waerde vaan 6,2±0,3 (Afb. S14) gief aon dat d’r gein UQ-mole zien opgelos. sjtruktuur.
De pseudo-symmetrische L- en M-polypeptides bevatte eder vijf TMH’s en vörme un heterodimeer dee ein BChl-dimeer, twie BChl-monomere, twie bacteriofage (BPh) monomere en ein neet-Heme-iezer en ein of twie UQ10-molecule combineert. Door de aanwezigheid vaan waterstofbindinge op de terminale ketoongroep en de bekinde accumulatie in Rps, weure carotenoïde opgenome in de M-sub-einheid, dee cis-3,4-dehydroorhodopine weurt geneump. Soorte (25). ‘t Boete membraan domein vaan RC-H is door ein TMH aon ‘t membraan geankerd. De algehele RC-structuur is vergeliekbaar mit de drei subeenhede RC vaan verwante soorte (zoe es Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). De macrocycli vaan BChl en BPh, de carotenoïde ruggegraot en neet-heem iezer euverlappe binne ‘t resolutiebereik vaan dees structure, zjus wie de UQ10-hoofgroep op de QA-site en de QB-quinon op RC-LH116 (Figuur S15).
De besjikbaarheid vaan twie RC-structure mit versjillende QB-locatie-bezettingspercentages beejt un nuuje kans um de consistente conformationele veranderinge die mit QB-quinonbinding gepaard goon te oonderzeuke. In ‘t RC-LH116-complex bevindt zich QB-quinon in de volledig geboonde “proximale” positie (26), mer de sjeiing vaan RC-LH114-W heet gein QB-quinon. D’r is gein QB-quinon in RC-LH114-W, wat verrassend is umtot ‘t complex actief is, mie es ‘t RC-LH116-complex mit structureel opgelosde QB-quinon. Alhoewel de twie LH1-ringe ongeveer zès quinone chelate, zien vijf structureel opgelos in de geslote RC-LH116-ring, terwijl mer drei structureel beperk zien in de ope RC-LH114-W-ring. Deze verhoegde structurele aandoening kin de snellere vervaanging vaan RC-LH114-W QB-sites, snellere quinonekinetica in ut complex en ‘n verhoogde kans um de LH1-lus te kruusen weerspiegele. We suggerere dat ‘t gebrek aan UQ in de RC QB-locatie vaan RC-LH114-W ‘t resultaat kin zien vaan ‘n complexer en actiever complex, en de QB-locatie vaan RC-LH114-W is onmiddellik bevrore in de UQ-omzet.
Zoonder QB, de bijbehurende rotatie vaan L-Phe217 nao ‘n positie dee neet verenigbaar is mèt UQ10-binding, umtot ‘t ‘n ruimteleke bótsing mèt de ierste isopreen-eenheid vaan de sjtart zal veroorzake (Figuur 6A). Daoneve zien de duudelike hoofconformationele veranderinge duudelik, veural de helix de (korte helix in de lus tusse TMH D en E) boe L-Phe217 nao de QB-bindingszak weurt versjoof en de rotatie vaan L-Tyr223 (Figuur 6A) Um de waterstofbinding mèt ‘t M-Ap4-kader te breke en ‘t binding vaan QB-kader te slute site (Figuur 6B). Helix de drejt op ziene basis, de Cα vaan L-Ser209 is versjoof mit 0,33Å, onderwieles dat de L-Val221Cα is versjoof mit 3,52Å. D’r zien gein woernumbare veranderinge in TMH D en E, die in beide structure euvereinplaatsbaar zien (Figuur 6A). Veur zoewiet we wete, is dit de ierste structuur in de natuurlike RC dee de QB-locatie sluit. ‘n Vergelieking mit de complete (QB-gebonde) structuur toent aon dat veurtot de quinon weurt gereduceerd, ‘n conformationele verandering nuudig is um ‘t in de quinon te laote binnegoon. L-Phe217 drejt um ‘n π-stapelende interactie te vörme mit de quinone hoofgroep, en de helix versjuif nao boete, boedoor ‘t skelet vaan L-Gly222 en de zijketting vaan L-Tyr223 ‘n waterstofbindingsnetwerk mit ‘n stabiele waterstofbindingsstructuur kinne vörme (Figuur 6, A en C).
(A) Euverlappende tekenfilm vaan hologram (L-ketting, oranje/M-ketting, magenta) en apo (gries) structuur, boe-in de sleutelreste weure weergegeve in de vörm vaan ‘n staaf-achtige representatie. UQ10 weurt weergegeven door un gele balk. De stippellijn gief de waterstof bindinge aon dee in de ganse structuur zien gevörmp. (B en C) De oppervlaktevertegenwoordiging vaan ‘t apolipoproteïne en de ganse ringstructuur, die de zuurstof vaan de zijketting vaan L-Phe217 in blauw en L-Tyr223 in roed benaodrök, respectievelik. De L-subeinheid is oranje; de M- en H-sub-einhede zien neet gekleurd. (D en E) Apolipoproteïne (D) en ganse (E) RC QB-sites [kleur door (A) respectievelik] en Thermophilus thermophilus PSII (greun, blauw mit plastic quinon; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Onverwachs, hoewel d’r versjèllende structure vaan QB-deficiënte RC’s zoonder LH1 besjikbaar zien, zien de conformationele veranderinge die in dit oonderzeuk zien gezeen nog neet veurheen gerapporteerd. Dit umvat de QB-oetputtingsstructuur vaan Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) en Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), die allemaol bekans ‘tzelfde zien es hun algehele QB-structuur. Nauwkeurige inspectie vaan 3PRC onthulde dat LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) wasmiddelmolecule zich binne aon de ingang vaan de QB-positie, wat herrangsjikking in ‘n geslote conformatie kin veurkoume. Alhoewel LDAO neet op dezelfde positie in 1EYS of 1OGV ontbind, weure dees RC’s veurbereid mit ‘tzelfde wasmiddel en kinne daorum ‘tzelfde effek producere. De kristalstructuur vaan Rba. Sphaeroides RC co-kristalliseerd mit cytochroom c2 (PDB ID: 1L9B) liek ouch ‘n geslote QB-locatie te höbbe. In dit geval nump ‘t N-terminale regio vaan ‘t RC-M-polypeptide (de interactie mit de QB-bindingsplaats via de H-binding vaan ‘t Tyr-residu op de Q-helix) echter ‘n onnatuurleke conformatie aon, en de QB-conformatieverandering weurt neet wiejer oonderzeuk (30 ). Wat geruststellend is, is dat ver dit soort vervörming vaan ‘t M-polypeptide in de RC-LH114-W-structuur neet höbbe gezeen, wat bekans ‘tzelfde is es ‘t N-terminale gebeed vaan RC-LH116 RC. D’r mot ouch weure opgemerk dat nao de uitroeiing vaan de op wasmiddel gebaseerde LH1-antenne, de apolipoproteïne RC’s in de PDB woorte opgelos, wat de interne quinonpoele en lipide in de kloof tösse de RC en ‘t binnenste oppervlak vaan de umringende LH1-ring elimineerde (31, 32). RC blief functioneel umtot ‘t alle cofactore behoudt, behalve de ontbindbare QB-quinon, wat minder stabiel is en dèks verlore geit tijdens ‘t veurbereijingsproces (33). Daoneve is ‘t bekind dat de verwijdering vaan LH1 en natuurlike cyclische lipide oet RC ‘n invlood kin höbbe op functies, wie de verkorte levesduur vaan de door laojing gesjeie P+QB-staot (31, 34, 35). Daorum speculere veer dat ‘t bestoon vaan de lokale LH1-ring um de RC heen de “geslote” QB-locatie kin behawwe, en zoedoende de lokale umgeving in de buurt vaan de QB kin behawwe.
Alhoewel apolipoproteïne (zónder QB-quinon) en de complete structuur mer twie momentopname vaan de umzet vaan de QB-site vertegenwoordige, in plaots vaan ‘n reeks gebäörtenisse, zien d’r aonwiezinge dat de binding kin weure aafgeslote um herbinding door hydroquinon te veurkoume. De interactie vaan quinolol en quinon in de buurt vaan de QB-site vaan apolipoproteïne kin aanders zien, wat leidt tot de aofwiezing door RC. ‘t Is lang veurgesteld gewore tot conformationele veranderinge ‘n rol speule in ‘t binden en reductie vaan quinones. ‘t Vermoge vaan bevrore RC’s um quinones te vermindere nao duuster aanpassing is verslechterd (36); Röntgenkristallografie toent aon dat dees sjaoj te wiete is aon ‘t feit dat QB-quinone in ‘n “distale” conformatie ongeveer 4,5 Å vaanaof de actieve proximale positie (26) , 37 zien vasgezat. Ver suggerere dat dees distale bindingsvörming un momentopname is vaan de tussestaot tösse apolipoproteïne en de volledige ringstructuur, die de initiële interactie mit quinon en de opening vaan de QB-locatie volg.
‘t Type II RC dat in ‘t PSII-complex vaan bepaolde fototrofe bacterieje en cyanobacterieje, alge en plante weurt aongetroffe, heet structureel en functioneel behoud (38). De structurele lijning die in Figuur 6 (D en E) weurt getoend, benaodrök de euvereinkoms tusse PSII RC’s en de QB-locatie vaan ‘t bacteriële RC-complex. Dees vergelieking is lang ‘n model gewees veur ‘t bestudere vaan de nauw verwante systeme vaan quinonbinding en -reductie. Veurige publicaties suggereerde dat conformationele veranderinge vergezeld gaon mit PSII-reductie vaan quinone (39, 40). Daorum, gezeen de evolutionaire conservatie vaan RC, kin dit nog neet woergenome bindingsmechanisme ouch touwpasbaar zien op de QB-site vaan PSII RC in zuurstofgevölde fototrofe plante.
Rps ΔpufW (ongelabelde pufW-deletie) en PufW-His (C-terminal 10x His-getagd eiwit-W oetgedruk oet de natuurlike pufW-locus) stamme. palustris CGA009 woort besjreve in ós veurege werk (16). Dees stamme en de isogene wild-type awwer woorte trökgevoonde oet de vriezer door ‘n klein aontal celle op PYE (eder 5 g liter -1) (bewaard in LB bij -80 °C, bevattende 50% (w/v) glycerol) eiwit, gisextract en succinaat)agar [1,5%/v)plaat te strepe. De plaat woort euvernach in ‘t duuster bij kamertemperatuur oonder anaërobe umstandeghede geïncubeerd, en vervolgens verlicht mit wit leech (~50 μmolm-2 s-1) geleverd door OSRAM 116-W halogeen gloeilampe (RS Components, UK) veur 3 tot 5 daag totdat ein kolonie versjeen. ‘n Enkele kolonie woort gebruuk um 10 ml M22+ medium (41) aongevuld mit 0,1% (w/v) casaminozoere (hiernao M22) te inoculere. De kweek woort gegreujd oonder zuurstof umstandeghede in ‘t duuster bij 34°C mèt ‘t schudde mèt 180 rpm gedurende 48 oor, en daonao woort 70 ml vaan de kweek gedurende 24 oor oonder dezelfde umstandeghede geïnjecteerd. ‘n Semi-aërobe kweek mit ‘n volume vaan 1 ml weurt gebruuk um 30 ml M22-medium in ‘n 30 ml universele transparante glaze fles mit sjroeftop te inoculere en 48 oor laank door steriele magnetische krach te bestraole (~50μmolm-2 s-1). Daonao woort 30 ml vaan de kweek geïnfecteerd mit ongeveer 1 liter kweek oonder dezelfde umstandeghede, die vervolgens woort gebruuk um ongeveer 9 liter kweek te inoculere, verlich op ~200 μmolm-2 s-1 gedurende 72 oor. De celle woorte geoogs door centrifugatie bij 7132 RCF veur 30 minute, hersuspendeerd in ~10 ml vaan 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en bewaord bij -20°C totdat ze nuudig waore.
Nao ‘t ontdooie, voeg ‘n paar kristalle vaan deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) en twie Roche holoenzyme protease-remmertablette (Merck, UK) touw aon de hersuspendeerde celle. In un 20.000 psi Franse drökcel (Aminco, VS) woorte de celle 8 tot 12 kier versjteurd. Nao ‘t verwijdere vaan ononderbroke celle en onoplosbaar puin door centrifugatie bij 18.500 RCF veur 15 minute bij 4°C, woort ‘t membraan oet ‘t gepigmenteerde lysaat neerslag door centrifugatie bij 113.000 RCF veur 2 oor bij 43.000°C. Gooi de oplosbare fractie weg en suspendeer ‘t gekleurde membraan in 100 tot 200 ml vaan 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en homogeniseer tot d’r gein zichtbare aggregate zien. ‘t Gesuspendeerde membraan woort geïncubeerd in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, VS) mit 2% (w/v) β-DDM veur 1 oer in ‘t duuster bij 4°C mit zachte roering. Centrifugeer daan op 70°C um 150.000 RCF op te losse op 4°C gedurende 1 oer um euvergebleve onoplosbare stoffe te verwijdere.
‘t Oplosbare membraan vaan de ΔpufW-stam woort toegepas op ‘n 50 ml DEAE Sepharose-ionoetwisselingskolom mit drei kolomvolumes (CV) vaan bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8,0) bevattende 0,03% (w / v) β-DDM]. Was de kolom mit twie CV-bindingsbuffers en was de kolom daan mit twie bindingsbuffers mit 50 mM NaCl. ‘t RC-LH116-complex woort geëlueerd mit ‘n lineaire gradiënt vaan 150 tot 300 mM NaCl (in bindingsbuffer) op 1,75 CV, en ‘t euvergebleve bindingscomplex woort geëlueerd mit ‘n bindingsbuffer mit 300 mM NaCl op 0,5 CV. Verzamel ‘t absorptiespectrum tusse 250 en 1000 nm, hawwe de fractie mit ‘n absorptieverhouding (A880/A280) groeter es 1 op 880 tot 280 nm, verdun ‘t twie kier in de bindingsbuffer en gebruuk weer dezelfde proceduur op de DEAE-kolom Bij zuivering. Verdun de fracties mit A880/A280-verhawwinge hoeger es 1,7 en A880/A805-verhawwinge hoeger es 3,0, voer de derde runde vaan ionoetwisseling oet en behaww fracties mit A880/A280-verhawwinge hoeger es 2,2 en A880/A805-verhawwinge hoeger es 0,05.00. ‘t Gedeiltelik gezuuverde complex woort geconcentreerd tot ~2 ml in ‘n Amicon 100.000 moleculair gewiechscut-off (MWCO) centrifugaal filter (Merck, UK), en gelaoje op ‘n Superdex 200 16/600 groete exclusie kolom (GE Healthcare, VS) bevattende 200 mM NaCl buffer en vervolgens in ‘tzelfde buffer geëlueerd bij dezelfde buffer. CV. Verzamel de absorptiespectra vaan de gruutde-exclusiefractie en concentreer de absorptiespectra mit A880/A280-verhawwinge euver 2,4 en A880/A805-verhawwinge euver 5,8 tot 100 A880, en gebruuk ze onmiddellik veur de veurbereijing of opsjlaag vaan cryo-TEM-raster.
‘t Oplosbare membraan vaan de PufW-His-stam woort toegepas op ‘n 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolom (20 mM tris-HCl (pH 8,0) mèt 200 mM NaCl en 0,03% (w/w)) in IMAC-buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. De kolom woort gewasse mit vijf CV’s vaan IMAC-buffer en daonao mit vijf CV’s vaan IMAC-buffer mit 10 mM histidine. ‘t Kerncomplex woort oet de kolom geëlueerd mit vijf IMAC-buffers mit 100 mM histidine. De fractie die ‘t RC-LH114-W-complex bevat, weurt geconcentreerd tot ~10 ml in ‘n geroerde tank oetgerös mit ‘n Amicon 100.000 MWCO-filter (Merck, UK), 20 kier verdund mit bindingsbuffer, en vervolgens toegeveug aon 25 ml In de DEAE Sepharose-kolom weure veer CV-buffers gebruuk in de b-buffer. Was de kolom mit veer CV-bindingsbuffers, elueer daonao ‘t complex op ach CV’s op ‘n lineaire gradiënt vaan 0 tot 100 mM NaCl (in bindingsbuffer), en de euvergebleve veer CV’s die 100 mM bindingsbuffer bevatte. A880/A805-ratio hoeger es 4,6 fracties woorte geconcentreerd tot ~2 ml in un Amicon 100.000 MWCO centrifugaal filter, en gevöld mit 1,5 CV IMAC veuraf. Verzamel de absorptiespectra vaan de gruutde-oetsjloetingsfracties en concentreer de absorptiespectra mit A880/A280-verhawwinge euver 2,1 en A880/A805-verhawwinge euver 4,6 tot 100 A880, die onmiddellik were gebruuk veur de veurbereijing vaan ‘n bevrore TEM-rooster of weure opgeslage bij -8°C tot ‘t nuudig is.
‘n Leica EM GP immersievrieskast woort gebruuk um TEM-roosters mit lieg temperatuur veur te bereide. ‘t Complex woort in IMAC-buffer verdund tot A880 vaan 50, en daonao woort 5μl gelaoje op ‘n nuuj gloeiende QUANTIFOIL 1.2/1.3-koolstofgelaagde kopere maas (Agar Scientific, UK). Incubeer ‘t rooster bij 20°C en 60% relatieve vochtigheid veur 30 s, druug ‘t daan veur 3 s en doek ‘t daan in vloeibaar ethaan bij -176°C.
De data vaan ‘t RC-LH114-W-complex woorte opgenome op ‘t eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) mèt ‘n Titan Krios-microscoop, dee wèrk op ‘n versnellende spanning vaan 300kV, mèt ‘n nominale vergroeting vaan 130.000× en ‘n energie vaan ‘n gap vaan 200V. ‘n Gatan 968 GIF Quantum mit K2-piekdetector woort gebruuk um aafbeeldinge in tèllingsmodus op te neume um data te verzamele. De gekalibreerde pixelgrootte is 1,048Å en de dosissnelheid is 3,83 e-Å-2s-1. De film in 11 seconde verzameld en in 40 deile verdeild. Gebruuk ‘t mit koolstof bedekte gebeed um de microscoop opnuuj te focusere en verzamel daonao drei films per gaat. In totaal woorte 3130 films verzameld, mit defocuswaardes tösse -1 en -3μm.
De data veur ut RC-LH116-complex woorte verzameld met behulp vaan dezelfde microscoop in ut Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). De data woort verzameld in tèllingsmodus mit un vergroeting vaan 130 k, en de pixelgrootte woort gekalibreerd op 1,065 Å mit un dosis vaan 4,6 e-Å-2s-1. De film woort in 12 seconde opgenomme en in 48 deile verdeild. In totaal woorte 3359 films verzameld, mit defocuswaarde tusse -1 en -3μm.
Alle gegevensverwèrking weurt oetgeveurd in de Relion 3.0-pijplijn (42). Gebruik Motioncorr 2 (43) um de beweging vaan de sjtraol te corrigere door dosisweging, en gebruuk vervolgens CTFFIND 4.1 (44) um de parameter CTF (contrasttransferfunctie) te bepaole. Typische fotomicrofoto’s nao dees ierste verwerkingsfases zien in Figuur 2 getoend. S16. ‘t Automatische selectiesjabloon weurt gegenereerd door handmatig ongeveer 250 pixels vaan 1000 deilkes in ‘n 250-pixel frame en gein referentie twie-dimensionale (2D) classificatie te selectere, zoedoende de classificaties die aon de steekproefbesmetting voldoon of gein dudelike kinmerke höbbe, weure aafgeweze. Daonao woort automatische selèctie oetgeveurd op alle microfoto’s, en de RC-LH114-W waor 849.359 deilkes, en ‘t RC-LH116-complex waor 476.547 deilkes. Alle geselecteerde deilkes höbbe twie rundes vaan neet-referentie 2D-classificatie oondergaange, en nao eder run weure de deilkes die ‘t koolstofgebeed, steekproefbesjmetting, gein dudelike kenmerke of sterk euverlappende deilkes voldoon, aafgeweze, wat resulteert in 772.033 (90,9%) en 359.678 (75,5%) deilkes die weure gebruuk veur de classificatie vaan 3D-deilkes. RC-LH114-W en RC-LH116 respectievelik. ‘t Ierste 3D-referentiemodel woort gegenereerd met behölp vaan de stochastische gradiëntafdalingsmethode. Door ‘t ierste model es referentie te gebruke, weure de geselecteerde deilkes in 3D in veer categorieje ingedeild. Door ‘t model in deze categorie es referentie te gebruke, 3D-raffinatie oet op de deilkes in de groetste categorie, gebruuk daan ‘t ierste 15Å-laagdoorlaotfilter um ‘t oplossergebeed te bedekke, voeg 6 pixels zachte kante touw en post-verwèrk de pixels um de Gatan K2-piekmodulatie-euverdrachsfunctie vaan de topdetector te corrigere. Veur de RC-LH114-W-dataset woort dit ierste model aongepas door de sterke dichtheid aon de rande vaan ‘t masker te verwijdere (oetkoppeld vaan de kerncomplexdichtheid in UCSF Chimera). De resulterende modelle (de resoluties vaan RC-LH114-W en RC-LH116 zien respectievelik 3,91 en 4,16 Å) weure gebruuk es referentie veur de twiede runde vaan 3D-classificatie. De gebruukde deilkes zien gegroepeerd in de ierste 3D-klasse en bevatte gein sterke correlatie mit de buurt. Euverlapping of gebrek aan dudelike structurele kinmerke. Nao de twiede runde vaan 3D-classificatie woort de categorie mit de hoegste resolutie geselecteerd [Veur RC-LH114-W is ein categorie 377.703 deilkes (44,5%), veur RC-LH116 zien d’r twie categorieje, in totaal 260.752 deilkes (54,7% W), es ze allein nao de zelfde zien geligneerd es ze allein nao de zelfde zien geligneerd. initiële rotatie mit un klein versjil]. De geselecteerde deilkes were weer geëxtraheerd in ‘n 400-pixel doos en geraffineerd door 3D-raffinatie. ‘t Oplosmiddelmasker weurt gegenereerd mit behulp vaan ‘t ierste 15Å laagdoorlaotfilter, 3 pixel map-oetbreiing en 3 pixel zachte masker. Door per-deilke CTF-verfijning, per-deilke bewegingscorrectie en de twiede ronde per-deilke CTF-verfijning, weurt nao eder stap 3D-verfijning, oplosmiddelmaskering en naverwèrking oetgeveurd um de resulterende textuur nog wiejer te verfijne. Mit behulp vaan de FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) grenswaarde vaan 0,143 zien de resoluties vaan de finale modelle vaan RC-LH114-W en RC-LH116 respectievelik 2,65 en 2,80Å. De FSC-curve vaan ‘t finale model is te zien in Figuur 2. S17.
Alle eiwitsequenties zien gedownload vaan UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) woort gebruuk um un homologiemodel vaan RC te make, wat de eiwitsequenties vaan RC-L, RC-M en RC-H en de kristalstructuur vaan Rba bevat. sphaeroides RC woort gebruuk es sjabloon (PDB ID: 5LSE) (46). Gebruik ‘t “fit map”-hulpmiddel in UCSF Chimera um ‘t gegenereerde model op de kaart te passe (47), de eiwitstructuur te verbetere en cofactore [4×BChl a (monomeerbibliotheekresidu naam = BCL), 2×BPh a (BPH), ein of twie soorte UQ10 (U10), ein neet-heem iezer (Fe) en ein heksadichohydrocarycoline. (QAK)] gebruuk Coot (48) um ​​op te tèlle. Umdet QAK neet besjikbaar is in de monomeerbibliotheek, woort ‘t geparametriseerd met behölp vaan ‘t eLBOW-hulpmiddel in PHENIX (49).
Vervolgens woort de LH1-subeinheid geconstrueerd. In ‘t begin woort ‘t automatische constructiehulpmiddel in PHENIX (49) gebruuk um automatisch ‘n deil vaan de LH1-sequentie te make mit behulp vaan de kaart en de LH1-α- en LH1-β-eiwitsequenties es invoer. Selecteer de meis complete LH1-sub-eenheid, extrahere ‘m en laad ‘m in Coot, voeg de oontbrekende sequentie handmatig touw en verfijn de ganse structuur handmatig veurtot twie BCls a (BCL) en ‘n spirilloxanthin (CRT) touwveug [volgens de relevante Rps De dichtheid vaan ‘t LH1-complex en de bekinde carotenoïde-inhoud. Soorte (17)]. Kopieer de complete LH1-sub-einheid en gebruuk de UCSF Chimera “Docking Map Tool” um in ‘t naburige neet-modelgebied vaan LH1-dichtheid te dokke, en verfijn ‘t daan in Coot; herhaol ut proces totdat alle LH1-sub-einhede zien gemodelleerd. Veur de RC-LH114-W-structuur, door de neet-toegeweze dichtheid in de Coot te extrahere, weurt ‘t eiwit gesegmenteerd oet de euvergebleve neet-eiwitcomponeente in de USCF Chimera-kaart en ‘t Autobuild-hulpmiddel weurt gebruuk um ‘t initiële model vas te stèlle, en de euvergebleve sub-einhede (eiwit-W) Modellering. In PHENIX (49). Voeg alle oontbrekende sequenties toe aan ut resulterende model in Coot (48) en verfijn vervolgens de ganse subeenheid handmatig. De euvergebleve neet-toegeweze dichtheid pas bij de combinatie vaan lipide (PDB-monomeerbibliotheek ID vaan CDL = CDL, POPC = 6PL en POPG = PGT), β-DDM wasmiddel (LMT) en UQ10-molecule (U10). Gebruik PHENIX-optimalisatie (49) en handmatige optimalisatie in Coot (48) um ​​‘t complete initiële model te perfectionere totdat de modelstatistieke en de visuele kwaliteit vaan de pasvorm neet wijer kinne weure verbeterd. Gebruuk ten slotte LocScale (50) um de lokale kaart te sjerpe en voer vervolgens versjèllende aandere cyclusse oet vaan ‘t modellere vaan de neet-toegeweze dichtheid en automatische en handmatige optimalisatie.
De respectievelike peptide, cofactore en aandere lipide en quinone die binne hun respectievelike dichthede zitte, zien in figure 1 en 2 getoend. S18 tot S23. De statistische informatie vaan ‘t finale model weurt in Tabel S1 getoende.
Tenzij anders vermeld, woorte de UV/Vis/NIR-absorptiespectra verzameld op ‘n Cary60-spectrofotometer (Agilent, VS) mit intervalle vaan 1 nm vaan 250 nm tot 1000 nm en ‘n integratietied vaan 0,1 s.
Verdun ‘t monster in ‘n kwartscuvette mit ‘n paad vaan 2 mm nao A880 vaan 1, en verzamel ‘t absorptiespectrum tusse 400 en 1000 nm. De cirkelvormige dichroïsche spectra woorte verzameld op un Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) mit intervalle vaan 1 nm tusse 400 nm en 950 nm mit un scansnelheid vaan 20 nm min-1.
De molaire oetstervingscoëffisjent weurt bepaold door ‘t kerncomplex te verdunne tot ‘n A880 vaan ongeveer 50. Verdun ‘t volume vaan 10μl in 990μl bindingsbuffer of methanol en verzamel ‘t absorptiespectrum direk um BChl-aafbraok te minimalisere. De BChl-inhoud vaan eder methanolmonster woort berekend door de oetstervingscoëffisjent op 771 nm vaan 54,8 mM-1 cm-1, en de oetstervingscoëffisjent woort bepaold (51). Deil de gemete BChl-concentratie door 32 (RC-LH114-W) of 36 (RC-LH116) um de kerncomplexconcentratie te bepaole, die daonao weurt gebruuk um ‘t absorptiespectrum vaan ‘tzelfde monster te bepaole dat in de buffer Extinction-coëffisjent is verzameld. párálèl. Veur eder monster woorte drei herhaolde metinge gedoon en de gemiddelde absorptie vaan ‘t BChl Qy-maximum woort gebruuk veur de berekening. De oetstervingscoëffisjent vaan RC-LH114-W gemete op 878 nm is 3280±140 mM-1 cm-1, terwijl de oetstervingscoëffisjent vaan RC-LH116 gemete op 880 nm 3800±30 mM-1 cm-1 is.
UQ10 woort gekwantificeerd volgens de methode in (52). Kort samegevat, umkierde fase HPLC (RP-HPLC) woort oetgeveurd met behulp vaan ut Agilent 1200 HPLC-systeem. Los ongeveer 0,02 nmol RC-LH116 of RC-LH114-W op in 50 μl vaan 50:50 methanol:chloroform mit 0,02% (w/v) iezerchloride, en injecteer de veur-equilibreerde Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 mml op in 1-1-1-m. 40°C in HPLC-oplosser (80:20 methanol:2-propanol) op un ×25 cm kolom. Voer isocratische elutie oet in un HPLC-oplosser um de absorptie op 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoïde) en 780 nm (BChl) gedurende 1 oer te monitore. De piek in ‘t 275 nm chromatogram op 25,5 minute woort geïntegreerd, wat gein aandere detecteerbare verbindinge bevatte. ‘t Geïntegreerde oppervlak weurt gebruuk um de molaire hoeveelheid UQ10 te beraekene die is geëxtraheerd mèt verwiezing nao de kalibreringscurve beraekend op basis vaan de injectie vaan pure standaarde vaan 0 tot 5,8 nmol (Figuur S14). Eder steekproef woort geanalyseerd in drie replica’s, en de gerapporteerde fout steit euverein mit de SD vaan ‘t gemiddelde.
‘n Oplossing mit ‘t RC-LH1-complex mit ‘n maximale Qy-absorptie vaan 0,1 woort bereid mit 30 μM gereduceerd peerdhartcytochroom c2 (Merck, Vereineg Keuninkriek) en 0 tot 50 μMUQ2 (Merck, Vereineg Keuninkriek). Drei 1-ml-monsters woorte veurbereid bij eder UQ2-concentratie en euvernach in ‘t duuster bij 4°C geïncubeerd um volledige aonpassing aon ‘t duuster veur de meting te verzekere. De oplossing woort gelaoje in ‘n OLIS RSM1000 modulaire spectrofotometer oetgerös mit ‘n 300 nm vlam/500 lijnrooster, 1,24 mm inlaat, 0,12 mm middelste en 0,6 mm oetlaotgleuve. ‘n 600 nm lang doorlaopfilter weurt geplaats bij de ingaank vaan de steekproeffotobuis en de referentiefotovermeinigvöldigerbuis um excitatieleech oet te slete. De absorptie woort gecontroleerd op 550 nm mit un integratietied vaan 0,15 s. ‘t Excitatieleech weurt oetgezonde vaan de 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) via ‘n glaasvezelkabel mit 90% intensiteit via ‘n DC2200-controller (Thorlabs Ltd., UK) en weurt oetgezonde nao de leechbron in ‘n hook vaan 90°. De meetstraol is tegeneuver de spiegel um alle leech trök te bringe wat in ‘t begin neet door ‘t monster woort geabsorbeerd. Controleer de absorptie 10 s veur de verlichting vaan 50 s. Daonao woort de absorptie 60 s in ‘t duuster wiejer gecontroleerd um te beoordeile in welke maote quinolol spontaan cytochroom c23 + vermindert (zuug Figuur S8 veur ruwe data).
De gegeves woorte verwèrk door ‘n lineaire initiële snelheid binne 0,5 tot 10 s (aafhankelik vaan de UQ2-concentratie) te passe en de snelhede vaan alle drei de monsters bij eder UQ2-concentratie te gemiddelde. De RC-LH1-concentratie beraekend door de respectievelike oetstervingscoëffisjent woort gebruuk um de snelheid um te zette in de catalytische efficiëntie, geplot in Origin Pro 2019 (OriginLab, VS) en gepas op ‘t Michaelis-Menten-model um de sjijnbare Km- en Kcat-waardes te bepaole.
Veur veurbiegende absorptiemetinge woort ‘t RC-LH1-monster verdund tot ~2μM in IMAC-buffer mit 50 mM natriumascorbaat (Merck, VS) en 0,4 mM Terbutine (Merck, VS). Ascorbienzuur weurt gebruuk es ‘n opofferende elektrondonor, en tert-butaclofen weurt gebruuk es ‘n QB-remmer um te verzekere dat de hoof RC-donor gereduceerd blief (dat wil zègke neet fotooxideerd) gedurende ‘t ganse maotproces. Ongeveer 3 ml steekproef weurt toegeveug aon ‘n aangepaste roterende cel (ongeveer 0,1 m in diameter, 350 RPM) mit ‘n optische paadlengte vaan 2 mm um te verzekere dat ‘t monster in ‘t laserpaad genóg tied heet veur duustere aanpassing tusse excitatiepulse. Gebruik ~100-fs laserpulse um ‘t Ti: Sapphire lasersysteem (Spectra Physics, VS) te versterke um ‘t monster op te wekke op 880 nm mit ‘n herhalingssnelheid vaan 1 kHz (20 nJ veur NIR of 100 nJ veur Vis). Veurtot ge data verzamelt, stèl ut steekproef ongeveer 30 minute bloot aon excitatieleech. Blootstelling zal QA-inactievering veroorzake (meugelek QA ein of twie kier vermindere). Maar let op dat dit proces umkeerbaar is, want nao ‘n lange periode vaan duuster aanpassing zal RC langzaam trökgaon nao QA-activiteit. ‘n Helios-spectrometer (Ultrafast Systems, VS) woort gebruuk um transiënte spectra te mete mit ‘n vertragingstied vaan -10 tot 7000 ps. Gebruik Surface Xplorer-software (Ultrafast Systems, VS) um de gegevenssets te ontgroepe, vervolgens same te voge en te standeerdisere. Gebruik ‘t CarpetView-softwarepakket (Light Conversion Ltd., Litouwen) um de gecombineerde gegevensset te gebruke um differensjele spectra gerelateerd aon verval te kriege, of gebruuk ‘n functie dee mierdere exponente mèt de instrumentrespons umvat um de spectrale evolutie vaan ein golflengte in Origin (OriginLab, VS) te passe.
Zoals heibove vermeld (53), woort ‘n fotosynthetische film mit LH1-complex veurbereid mit zowel RC- es perifere LH2-antenne. ‘t Membraan woort verdund in 20 mM tris (pH 8,0) en vervolgens in ‘n kwartscuvette mit ‘n optisch paad vaan 2 mm gelaoje. ‘n 30nJ laserpuls woort gebruuk um ‘t monster op te wekke op 540 nm mit ‘n vertragingstied vaan -10 tot 7000 ps. Verwèrk de gegevensset zoewie besjreve veur Rps. pal monster.
‘t Membraan woort gepelleteerd door centrifugatie bij 150.000 RCF veur 2 oor bij 4°C, en daonao woort de absorptie bij 880 nm hersuspendeerd in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en 200 mM NaCl. Los ‘t membraan op door 2% (w/v) β-DDM langzaam in te roere veur 1 oor in ‘t duuster op 4°C. ‘t Monster woort verdund in 100 mM triethylammoniumcarbonaat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) tot ‘n eiwitconcentratie vaan 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyse). Wiejere verwèrking woort oetgeveurd op basis vaan de eerder gepubliceerde methode (54), beginnend mit de verdunning vaan 50 μg eiwit in ‘n totaal vaan 50 μl TEAB mèt 1% (w/v) natriumlauraat (Merck, UK). Nao sonicatie veur 60 s woort ‘t gereduceerd mit 5 mM tris(2-carboxyethyl)fosfien (Merck, UK) bij 37°C veur 30 minute. Veur S-alkylatie, incubeer ‘t monster mit 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonaat (Merck, UK) en voeg ‘t toe vaan ‘n 200 mM isopropanol veurraoplossing veur 10 minute bij kamertemperatuur. Proteolytische spijsvertering woort oetgeveurd door 2 μg trypsine/endoproteinase Lys-C-mengsel (Promega UK) toe te voge en 3 oor bij 37°C geïncubeerd. ‘t Lauraatsurfactant woort geëxtraheerd door 50 μl ethylacetaat en 10 μl 10% (v/v) LC-kwaliteit trifluorazinzuur (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) toe te voge en door 60 s te vortexe. De fasesjeijing woort bevorderd door centrifugatie op 15.700 RCF veur 5 minute. Volgens ‘t protocol vaan de fabrikant woort ‘n C18-spinkolom (Thermo Fisher Scientific, UK) gebruuk um de liegere fase die ‘t peptide bevatte, veurzichtig te aspirere en te ontzoete. Nao ut dreuge door vacuümcentrifugatie woort ut monster opgelos in 0,5% TFA en 3% acetonitriel, en 500 ng woort geanalyseerd door nanoflow RP-chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie met behulp vaan de eerder gedetailleerde systeemparameters.
Gebruik MaxQuant v.1.5.3.30 (56) veur eiwitidentificatie en kwantificatie um Rps te zeuke. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). De massaspectrometrie-proteomische data is gedeponeerd in de ProteomeXchange Alliance via de PRIDE-partnerrepository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) oonder de dataset-identificator PXD020402.
Veur analyse door RPLC gekoppeld aon elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie woort ‘t RC-LH1-complex veurbereid vaan wild-type Rps. Mit gebruuk vaan de eerder gepubliceerde methode (16) waor de eiwitconcentratie geproduceerd in palustris-celle 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl en 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad-analyse) ) DDM. Gebruuk volges ‘t protocol vaan de fabrikant ‘n 2D-zuiveringskit (GE Healthcare, VS) um 10 μg eiwit te extrahere door de neerslagmethode en los ‘t neerslag op in 20 μl 60% (v/v) mierzuur (FA), 20% (v/v) acetonitriel en 20% (v/v) water. Vijf microliter woorte geanalyseerd door RPLC (Dionex RSLC) gekoppeld aon massaspectrometrie (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gebruik MabPac 1,2×100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, UK) veur sjeiing bij 60°C en 100μlmin -1, mit un gradiënt vaan 85% (v / v) oplosmiddel A [0,1% (v / v) FA en 0,02% (V/v) TFA waterige oplosmiddel] tot 5% Bv/v) [0,1%(v/v) FA en 0,02%(v/v) in 90%(v/v) acetonitriel TFA] Door de standaard elektrospray-ionisatiebron en standaardparameters veur mie es 60 minute te gebruke, krieg de massaspectrometer 100 tot 2750 m/z (massa-ladingverhouding). Mèt de hulp vaan ‘t ExPASy bioinformatica bronneportaal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), maak ‘t massaspectrum in kaart nao de sub-einhede vaan ‘t complex.
De celle woorte 72 oor gegreujd oonder 100 ml NF-lieg (10μMm-2 s-1), gemiddeld (30μMm-2 s-1) of hoeg (300μMm-2 s-1) leech. M22-medium (M22-medium boe-in ammoniumsulfaat weurt weggelaote en natriumsuccinaat weurt vervange door natrium-acetaat) in ‘n 100 ml-sjroeffles (23). In vijf cycli vaan 30 seconde woorte 0,1 micron glaaskraole gekräöld in ‘n volumeverhouding vaan 1:1 um de celle te lysere en 5 minute op ies gekoeld. De onoplosbare materie, de ononderbroke celle en de glaaskraole woorte verwijderd door centrifugatie op 16.000 RCF veur 10 minute in ‘n microcentrifuge op de bank. ‘t Membraan woort 10 oor lang gesjeije in ‘n Ti 70.1 rotor mit 100.000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) mit ‘n 40/15% (w/w) sucrosegradiënt.
Zoals besjreve in ós veurege werk, immunodetectie vaan de His-tag op PufW (16). Kort samegevat, ‘t gezuuverde kerncomplex (11,8 nM) of ‘t membraan mit dezelfde concentratie RC (bepaold door oxidatie boebij ‘t verminderde versjilsspectrum weurt aafgetrokke en de belasting op de gekleurde gel euvereinkomme) in 2x SDS-laadbuffer (Merck, UK) twie kier verdunt. De eiwitte woorte gesjeije op un replica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). ‘n Gel woort gekleurd mit Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) um de RC-L subeenheid te lade en te visualisere. ‘t Eiwit op de twiede gel woort euvergedrage nao methanol-geactiveerde polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Thermo Fisher Scientific, UK) veur immunoassay. ‘t PVDF-membraan woort geblokkeerd in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 en 5% (w / v) magermelkpoeder, en vervolgens geïncubeerd mit ‘t anti-His primair antilichaam (in ‘t verdun ‘t antilichaam buffer [50 mM tris-HCl 7.6), 150 mM NaCl en 0.05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, VS) veur 4 oor. Nao ‘t wasse vaan 3 kier gedurende 5 minute in antiliechaambuffer, woort ‘t membraan gecombineerd mit mierwortelperoxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-muis secundair antiliechaam (verdund 1:10.000 in antiliechaambuffer) Incubeer um detectie meugelek te make (5 minute nao 3 wasse in antiliechaambuffer) met behulp vaan CTA EAR20. chemiluminescentie substraat (Cyanagen, Italië) en Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Door de intensiteitsverdeiling vaan eder gekleurde gel of immunoassay-baan te teikene, door ‘t oppervlak oonder de piek te integrere en de intensiteitsratio vaan RC-L (gekleurde gel) en Protein-W (immunoassay) te berekene, in ImageJ (57) Verwèrk de beeld. Dees rasjo’s woorte umgezat nao molaire rasjo’s door aon te numme dat de ratio vaan RC-L tot eiwit-W in ‘t pure RC-LH114-W-monster 1:1 waor en de ganse gegevensset heiaan te normalisere.
Veur aanvullende materiaal veur dit artikel, zuug http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dit is un open touwgaank artikel dat weurt verspreid oonder de veurwaardes vaan de Creative Commons Attribution License. ‘t Artikel maak onbeperk gebruuk, verspreiding en reproductie in eder medium meugelek oonder de veurwaarde dat ‘t orzjineel werk goed is geciteerd.
Opmerking: Ver vraoge uuch allein um eur e-mailadres op te geve zodet de persoen dee geer aon de pagina aanbeveelt weit dat geer de e-mail wilt zeen en dat ‘t gein spam is. We zulle gein e-mailadresse vastlègke.
Deze vraog weurt gebruuk um te teste of geer un bezeuker zit en um automatische spam-inzending te veurkómme.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Hunter, Necoil.
De hoegresolutiestructuur vaan ‘t leechval 1-complex in ‘t reactiecentrum gief nuuj inzich in de quinondynamiek.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Hunter, Necoil.
De hoegresolutiestructuur vaan ‘t leechval 1-complex in ‘t reactiecentrum gief nuuj inzich in de quinondynamiek.
©2021 Amerikaanse Vereineging veur de Veuroetgaank vaan de Wetensjap. alle rechte veurbehawwe. AAAS is un partner vaan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.